CRISPR/Cas9介导的低产尿素黄酒酵母工程菌的构建

通过代谢工程改造构建低产尿素的酿酒酵母工程菌,从根源上减少黄酒发酵液中尿素的含量及氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)的形成。该研究利用融合PCR构建DUR3过表达组件"HOL-PGK1p-DUR3-PGK1tHOR",通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术转化酿酒酵母S. cerevisiae NaDUR1,2-Δcar1,在敲除CAR1和过表达DUR1,2基因的基础上过表达DUR3基因,获得工程菌S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1。实验室黄酒发酵实验结果表明,与亲本菌株S. cerevisiae Na相比,工程菌S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1所酿黄酒发酵液中尿素含量降低了92. 1%,EC含量降低了58. 6%;与出发菌株S. cerevisiae NaDUR1,2-Δcar1相比,工程菌S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1所酿黄酒发酵液中尿素含量降低了43. 4%,EC含量降低了16. 2%。过表达DUR3的工程菌S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1具有"尿素吸收"的能力,减少EC的形成。借助CRISPR/Cas9系统,构建的酵母工程菌无外源抗性基因的引入,具有工业化应用的潜在可能性。     

碳源对枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶的影响

研究可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖3种主要碳源对枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶活力、细菌浊度及其发酵培养过程中培养基pH值变化的影响.结果表明,枯草芽孢杆菌在摇床发酵试验中,当发酵时间超过54 h酶活力基本达到最高且保持不变.以可溶性淀粉为碳源时最佳,枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶酶活力最高为(114.5±2.3) U/mL,细胞浊度为2.342±0.023;其次是葡萄糖和蔗糖,最高酶活分别为(75.6±2.1),(72.2±1.2) U/mL,细胞浊度分别为2.515±0.031,2.421±0.044.可见枯草芽孢杆菌产生α-淀粉酶受淀粉的诱导,受蔗糖及葡萄糖的阻扼作用.     

一株碱性α-淀粉酶产生菌的筛选及产酶条件优化

目的 获取工业生产上有潜在应用价值的碱性淀粉酶产生菌.方法 土壤中筛选出5株产淀粉酶的菌株;经正交试验确定培养基的最优组成;通过摇瓶发酵初步确定了发酵条件.结果 产淀粉酶活性最高的为来源于草地土壤的菌株SⅡ-6,它在发酵8 h时产酶能力最强:优化后的培养基为玉米粉3%,蛋白胨0.8%,磷酸氢二钠0.6%,硫酸铵0.2%,氯化铵0.15%,pH 9.0.于40℃,180r/min条件下培养,菌株SⅡ-6酶活性可达到2 114U/mI,.结论 筛选出5株产淀粉酶的菌株,其中菌株SⅡ-6是1株耐碱性α-淀粉酶产生菌.     

β-淀粉酶酶解甘薯淀粉条件分析

麦芽糖可以诱导枯草芽孢杆菌产生中温α-淀粉酶,甘薯淀粉的β-淀粉酶酶解产物主要为麦芽糖。应用高效液相色谱示差折光检测法对不同酶解条件下甘薯淀粉β-淀粉酶酶解产物进行分析。结果表明,液化酶加入量为5~10U/g干淀粉时,酶解产物中葡萄糖的含量最高可达0.94%±0.048%,其含量较低,不会对枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶具有阻遏作用。酶解最佳条件为液化酶加入量5U/g干淀粉,β-淀粉酶最佳加入量为200U/g干淀粉,酶解最佳温度为60℃,最佳酶解时间为28h时,此条件下甘薯淀粉酶解产物中麦芽糖含量达75.8%±1.7%。甘薯淀粉β-淀粉酶酶解产物可以诱导β-淀粉酶酶解产物枯草芽孢杆菌发酵生产中温α-淀粉酶。研究对枯草芽孢杆菌发酵生产中温α-淀粉酶碳源优化具有重要意义。     

毕赤酵母高效表达重组β-葡萄糖醛酸苷酶的诱导方法研究

将甘草酸生物转化合成GAMG已成为国内外医药和食品行业研究的热点。该文在前期构建毕赤酵母(pichia pastoris)工程菌GS115-GUS的基础上,对重组毕赤酵母工程菌发酵条件进行了研究。通过单因素及正交试验建立工程菌最佳表达β-葡萄糖醛酸苷酶的诱导产酶方法:重组毕赤酵母GS115-GUS菌株在液体YPD培养基中活化24 h后,接种到BMGY中富集菌体,OD600达到6.0时,按照1∶1(V/V)的接种比率接入到pH为6.0的BMMY培养基中,加入1.5%诱导剂甲醇诱导产酶,且每隔24 h添加一次。该诱导产酶条件简单、易行、科学、合理,毕赤酵母高效表达GAMG的酶活高达1.97×103 U/mL,研究结果达到预期目标,为进一步研究重组酵母工程菌产β-葡萄糖醛酸苷酶的发酵水平、β-葡萄糖醛酸苷酶生物催化甘草酸制备GAMG以及工业化生产奠定基础。     

黑曲霉耐酸性α-淀粉酶的固态发酵条件研究

研究了固态发酵条件对黑曲霉(Aspergillus niger)PZ301合成酸性α-淀粉酶的影响。结果表明,固态发酵最佳培养基组成:麸皮7.0g,葡萄糖0.07g,淀粉0.21g,(NH4)2SO40.07g,起始pH 4.2;最佳培养条件为培养温度35℃,料水比为1∶1,接种量3mL(孢子浓度为107个/mL)。在上述条件下培养72h,酶活力可达19.6IU/g干培养基。另外还测定了PZ301固态发酵中生物量的变化,PZ301菌株的生物量和耐酸性α-淀粉酶在72h时均达到最高,这表明耐酸性α-淀粉酶系同步合成型酶。     

产α-淀粉酶海洋微生物的筛选及酶学性质研究

从福建平潭海域、台湾海峡等地采集海泥、海水样品,从中筛选得到1株产α-淀粉酶的菌株825,经16S rDNA鉴定为芽孢杆菌属。优化其产酶培养基,得到发酵培养基配方:可溶性淀粉2.0%,酵母膏0.5%,蛋白胨1.5%,培养基初始pH 7.0,发酵周期60 h。经优化后,α-淀粉酶活力从46.55 U/m L提高到77.44 U/m L,提高了66.36%。对其酶学性质的研究表明,该酶的最适反应温度70℃,在30~50℃稳定性较好,保温1 h仍可保持90%以上的酶活力;最适反应pH 7.0,在pH 5.0~9.0的缓冲液中保温1 h,相对酶活保持在70%以上,说明具有较宽的pH作用范围。     

重组毕赤酵母生产耐高温α-淀粉酶发酵条件的优化

利用重组毕赤酵母诱导表达可产生耐高温α-淀粉酶,在摇瓶发酵基础上,从诱导时间、甲醇添加量、pH值、接种量4个因素考察发酵条件对耐高温α-淀粉酶酶活力的影响,结合四元线性回归正交试验设计研究方法构建出甲醇诱导重组毕赤酵母生产耐高温α-淀粉酶的回归模型;优化最佳工艺参数为：诱导时间96h、甲醇添加量0.5%、接种量150mL/100mL、摇床转速200r/min。确定最优工艺条件下,耐高温α-淀粉酶酶活为217.2U/mL。     

麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

采用重叠PCR方法在麦芽糖α-淀粉酶编码基因5’端添加地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因信号肽编码区,获得重组基因BlMa。重组基因与芽孢杆菌表达载体pHY-P43连接后直接转化枯草芽孢杆菌,获得重组质粒pHY-P43-BlMa。枯草芽孢杆菌淀粉酶基因缺陷株1A717被用作BlMa基因表达宿主菌,重组菌命名为Bacillus subtilis/pHY-P43-BlMa。酶活检测和SDS-PAGE电泳均显示,B.subtilis/pHY-P43-BlMa表达的重组麦芽糖淀粉酶(BlMa)全部分泌到培养液中。HPLC检测表明,BlMa催化可溶性淀粉水解产物主要为麦芽糖。对B.subtilis/pHY-P43-BlMa摇瓶发酵条件进行优化。获得优化发酵培养基配方:10%玉米淀粉,2.5%药媒,0.3%(NH4)2SO4,0.03%CaCl2,0.1%NaH2PO4,在优化条件下重组菌发酵酶活为5.9 U/mL。     

真菌α-淀粉酶产生菌的筛选及其固态发酵条件的初步研究

从酒曲和酒药中分离筛选出一株产α-淀粉酶的菌株A019。经形态学初步鉴定为米曲霉。研究了碳源、氮源、培养温度与时间等因素对A019产酶的影响,并用响应面法对培养基组成进行了优化。最佳的培养基组成和培养条件为:麸皮8g,豆饼粉2.28g,酵母膏0.1g,K2HPO4·3H2O1%,MgSO4·7H2O0.094%,加水量12.9ml,培养基的起始pH5.0左右,28℃培养48h。在此条件下α-淀粉酶的酶活达到410U/g干曲左右。     

红色红曲菌液态发酵产胞外淀粉酶的研究

通过对红曲菌胞外淀粉酶活力的检测初步研究了红色红曲菌液态发酵产淀粉酶的特性。研究表明,红色红曲菌在液态发酵培养过程中分泌的胞外淀粉酶主要为葡萄糖淀粉酶,产酶时间略提前于红曲菌菌丝体生长高峰期,在培养第2天达到最高值。葡萄糖淀粉酶分泌的最适碳源为6%淀粉,最适氮源为2%蛋白胨,发酵最适条件为32℃,初始pH6,接种量5%。红曲菌产葡萄糖淀粉酶的较佳培养条件与红曲菌较适生长条件基本相符。红曲菌在液态发酵过程中几乎不产胞外α-淀粉酶。无论是固态培养还是液态发酵,红色红曲菌的产淀粉酶能力均低于紫色红曲菌。     

一株碱性α-淀粉酶产生菌的筛选及产酶条件优化

目的 获取工业生产上有潜在应用价值的碱性淀粉酶产生菌.方法 土壤中筛选出5株产淀粉酶的菌株;经正交试验确定培养基的最优组成;通过摇瓶发酵初步确定了发酵条件.结果 产淀粉酶活性最高的为来源于草地土壤的菌株SⅡ-6,它在发酵8 h时产酶能力最强:优化后的培养基为玉米粉3%,蛋白胨0.8%,磷酸氢二钠0.6%,硫酸铵0.2%,氯化铵0.15%,pH 9.0.于40℃,180r/min条件下培养,菌株SⅡ-6酶活性可达到2 114U/mI,.结论 筛选出5株产淀粉酶的菌株,其中菌株SⅡ-6是1株耐碱性α-淀粉酶产生菌.     

β-淀粉酶的表达与酶学性质

本研究在构建重组表达质粒p PIC-BBA的基础上,构建并筛选获得了高分泌表达大麦β-淀粉酶的重组巴斯德毕赤酵母GS-BBA。重组酵母在摇瓶发酵条件下,能够分泌表达180 U/m L的β-淀粉酶酶活力。进一步对该重组酶的酶学性质进行了分析,重组β-淀粉酶的最适作用温度为55℃,最适作用p H值为5.0,在不高于55℃和在p H 3.0~10.0之间有良好的热稳定性和p H值稳定性。重组酶水解淀粉的主要产物为麦芽糖,在普鲁兰酶的协助下,其水解淀粉形成麦芽糖的最大转化率为78.28%。     

SPSS软件在黑曲霉产异淀粉酶培养基优化中的应用

在固态发酵条件下,研究了碳源、氮源对黑曲霉(Aspergillus niger)淀粉酶系的影响,探索糖化酶、酸性α-淀粉酶及异淀粉酶的分泌规律;采用正交实验进一步优化产酶培养基,其方差分析和S-N-K法分析结果表明:黑曲霉产异淀粉酶的优化培养基分别为麸皮7.5g,葡萄糖0.06g,支链淀粉0.24g,酵母粉0.5g,营养盐8m L;在此基础上,缩短了异淀粉酶最高酶活形成时间,同时糖化酶、酸性α-淀粉酶最高酶活分别降低了36.7%和166%,这为异淀粉酶分离纯化提供了基础。     

樟绒枝霉α-淀粉酶在毕赤酵母中的高效表达及在麦芽糖浆制备中的作用

从嗜热真菌樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea)中克隆α-淀粉酶基因McAmyA,并在毕赤酵母GS115中高效表达,经高密度发酵至168 h时,胞外酶活力达到13 440. 6 U/mL。重组α-淀粉酶McAmyA粗酶液经QSFF强阴离子交换层析纯化得到电泳级纯酶,比酶活力为1 230. 2 U/mg。酶学性质研究表明,重组α-淀粉酶McAmyA的最适pH和最适温度分别是6. 5和65℃。以淀粉液化液为底物,在温度60℃,加酶量120 U/g,水解24 h的条件下,重组α-淀粉酶McAmyA水解液化液,制备得到麦芽糖含量为50. 0%(质量分数)的麦芽糖浆。该真菌α-淀粉酶在毕赤酵母中表达水平高,具有很大的应用潜力。     

基于响应面法优化α-淀粉酶酶解鹰嘴豆淀粉工艺及建模的研究

以葡萄糖值(DE)为考察指标,利用单因素实验和响应面法研究温度、p H及酶与底物比(E/S)对α-淀粉酶酶解鹰嘴豆淀粉制糖的影响。应用Lineweaver-Burk和Wilkinson统计法分别求解米氏常数(Km)和最大反应速度(Vm),并建立相应的动力学模型。结果表明:α-淀粉酶酶解鹰嘴豆淀粉制糖的最佳参数为:p H 6.5,温度55℃及E/S=0.12 U/mg,验证值为23.103%±0.454%。在30~50℃范围内,Ea=18.977 k J/mo L,ΔH=19.624 k J/mol。该研究为鹰嘴豆淀粉工业制糖提供理论依据。     

醋酸菌产乙醇脱氢酶发酵条件的研究

该研究对醋酸菌（Acetobacter pomorum）产乙醇脱氢酶（ADH）的发酵培养基的碳源和氮源进行了优化。采用单因素试验和响应面试验考察发酵温度、发酵时间、起始pH及接种量对乙醇脱氢酶比酶活的影响。在单因素试验的基础上,采用响应面试验进行发酵条件优化。结果表明,最佳发酵培养基配方为葡萄糖0.8%,酵母浸膏粉1.2%;最佳发酵工艺为发酵温度35 ℃、发酵时间72 h、起始pH 6.0、接种量6%。在此工艺条件下,ADH的比酶活为7 284 U/mg,与预测值（7 320 U/mg）的相对误差为0.49%。     

双酶法制备小麦微孔淀粉的动力学

为明确α-淀粉酶和糖化酶协同水解小麦淀粉制备微孔淀粉的动力学特征,以小麦A淀粉为材料,系统地分析pH值、反应温度、α-淀粉酶及糖化酶用量对水解速率的影响,并确定α-淀粉酶、糖化酶单一酶的米氏常数以及双酶协同效应。结果表明:在单一水解体系中,α-淀粉酶和糖化酶对小麦A淀粉的降解均遵循Michaelis-Menten方程,α-淀粉酶的米氏常数Km为9.548mg/mL,最大反应初速率(Vmax)为0.659mg/(mL.min),糖化酶以淀粉为底物的米氏常数(Km)为12.676mg/mL,最大反应初速率(Vmax)为0.555mg/(mL.min)。水解产物葡萄糖对反应体系具有竞争性抑制剂的作用,其抑制常数(Ki)为4.288mg/mL。在小麦A淀粉质量浓度为5mg/mL、α-淀粉酶10U/mL、糖化酶20U/mL、反应温度55℃、pH4.5、水解时间为25min的条件下,可达到淀粉的水解极限即还原糖生成质量浓度为2.54mg/mL。α-淀粉酶和糖化酶可协同水解小麦A淀粉制备微孔淀粉,双酶协同作用的水解效率明显高于单酶的水解效率。     

海洋细菌Pseudoalteromonas sp.G23产低温淀粉酶发酵条件的研究

从江苏连云港海域筛选和分离到1株产低温淀粉酶的海洋细菌Pseudoalteromonas sp.G23,对该菌株进行了产α-淀粉酶发酵条件研究,结果表明,该菌株发酵16h后到达产酶高峰,最适产酶温度为15℃,最适产酶pH值为8.5,装液量为20%。可溶性淀粉、酵母膏和蛋白胨促进产酶。利用响应面方法对菌株Pseudoalteromonas sp.G23产α-淀粉酶的发酵条件进行了优化,结果表明,可溶性淀粉浓度为1.16%、蛋白胨浓度为2.11%,发酵温度12.38℃,酶活为41.4U/mL,较优化前提高了7倍。     

丹参内生真菌产生淀粉酶菌株的筛选鉴定及酶学性质分析

目的:从丹参内生真菌中筛选耐热性强的酸性生淀粉酶菌株,并对其酶学性质进行初步研究。方法:以50株丹参内生真菌作为筛选对象,通过淀粉固体培养基初筛、液体发酵复筛,筛选产生淀粉酶活力较高的菌株;通过形态学观察和ITS序列分析对产酶菌株进行鉴定。结果:从50株丹参内生真菌中,筛选出5株产生淀粉酶活力较高的菌株,其中菌株ZDH2-2-1-1为产淀粉酶活性最强的菌株,酶活力达到117.63 U/m L,经鉴定为互隔链格孢(Alternaria alternata)。该淀粉酶最适p H为4.0,最适反应温度为55℃,具有较好的热稳定性和p H稳定性,对生淀粉具有广谱的降解能力。通过薄层层析发现,ZDH2-2-1-1所产淀粉酶的酶解产物为葡萄糖。结论:丹参内生真菌能产生高活性的耐热性酸性生淀粉酶,在生淀粉深加工中具有极大的开发潜力。