尿素吸收型工业黄酒酵母单倍体工程菌的构建

氨基甲酸乙酯是黄酒生产中的副产物,具有致癌性。尿素是氨基甲酸乙酯(EC)的主要前体物质,为降低黄酒中EC的含量,通过提高尿素转运蛋白基因DUR3的表达水平,构建了尿素吸收型工业黄酒酵母单倍体工程菌。采用融合PCR技术,将DUR3基因置于强启动子PGK1p后,构建过表达组件"URA3-PGK1p-DUR3-PGK1tURA3",转化工业黄酒酵母单倍体Na(MATa),获得单倍体工程菌Na-uD。通过实验室黄酒发酵,工程菌所酿黄酒发酵液中尿素含量降低了55.0%,EC含量降低了10.9%,其他理化指标无明显差异。因此过表达DUR3基因的工程菌Na-uD具有"吸收尿素"的能力,能够降低发酵液中尿素的含量,且无外源抗性基因的引入。     

低产尿素黄酒酵母工程菌的酿造特性

为考察酵母工程菌在黄酒酿造过程中的发酵性能及其降低发酵液中尿素和氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)的能力,以前期构建的降低黄酒中尿素和EC效果最好的酵母工程菌N85 DUR1,2-c为研究对象,利用单因素试验考察黄酒发酵工艺对其降低发酵液中尿素和EC能力的影响,并对其在生产试验过程中的发酵性能进行研究。结果表明,酵母接种量、发酵温度以及麦曲添加量等工艺参数对工程菌N85 DUR1,2-c低产尿素和EC的性能没有明显的影响,且含量低于亲本菌株。50 kL生产试验表明,工程菌N85 DUR1,2-c所酿黄酒中理化指标含量正常,符合黄酒国标的要求。而N85 DUR1,2-c发酵液中尿素和EC的含量分别为(2.4±0.2)mg/L和(14.9±0.6)μg/L,较亲本菌株分别降低了90.7%和54.6%,且贮存过程中EC含量增加缓慢。说明酵母工程菌N85 DUR1,2-c在不改变黄酒优良品质的前提下,能够显著地降低发酵液中尿素的含量,可以从根源上减少黄酒中EC的积累,提高饮用安全性。     

葡萄酒酵母car1基因表达量与EC含量相关性的研究

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)代谢精氨酸产生尿素对葡萄酒中氨基甲酸乙酯(carbamate ethyl,EC)含量的影响非常重要。利用实时荧光PCR技术,比较分析了18种酿酒酵母的发酵性能以及发酵期间酵母car1基因的表达活性与精氨酸、EC含量间的关系,结果表明:发酵期间,酵母car1基因的表达量均呈现先增加后降低的趋势,与发酵液中的精氨酸呈负相关关系,相关系数在0.990 3~0.997 7;而与EC含量呈现正相关关系,相关系数在0.624 9~0.995 8之间;不同酵母car1基因的相对表达量存在显著差异,筛选精氨酸酶活力低的酵母菌株可以有效降低葡萄酒中的EC含量。     

Saccharomy cescerevisiae氨基转移酶基因ARO8克隆及对3甲硫基丙醇合成的影响

酿酒酵母可通过艾希利(Ehrlich)途径将L-蛋氨酸转化为3-甲硫基丙醇等食品风味成分,本文研究了氨基转移酶及其基因在Ehrlich途径及3-甲硫基丙醇合成代谢的调控作用。从Saccharomyces cerevisiae S288C克隆氨基转移酶ARO8基因,并基于酿酒酵母-大肠杆菌穿梭型表达载体pYES-pgk,构建重组质粒表达载体pYES-pgk-ARO8,PEG/LiAc转化法将其导入S.cerevisiae S288C。结果表明,克隆的ARO8基因全长1503bp,与NCBI GenBank中酿酒酵母芳香族氨基转移酶Ⅰ编码基因ARO8的序列相似度为100%;构建的ARO8基因过表达工程菌S.cerevisiae AR8,其氨基转移酶活力为187U/mL,较野生型S288C菌株的酶活性提高1.63倍;工程菌AR8的摇瓶发酵3-甲硫基丙醇产量为0.76g/L,较野生型S288C提高28.8%。表明氨基转移酶Aro8p及其ARO8基因在S.cerevisiae 3-甲硫基丙醇合成代谢中发挥重要作用,增强其ARO8基因表达,有助于提高3-甲硫基丙醇的产量。     

具有α-淀粉酶分泌活性而低产氨基甲酸乙酯的酵母菌构建

为了构建可利用淀粉而低产氨基甲酸乙酯的酵母菌株,通过构建分别含ADH1和ADH2启动子的α-淀粉酶表达载体pADH1/alp1和pADH2/alp1,并将其分别转入精氨酸酶基因缺失的酵母菌株SΔcar1中。在此基础上,分析比较其在固态和液态条件下产α-淀粉酶的能力以及葡萄糖对α-淀粉酶表达的影响。结果表明:可利用淀粉而低产氨基甲酸乙酯的黄酒酵母SΔcar1/A1和SΔcar1/A2已成功构建。SΔcar1/A1在固体和液体培养基中产生淀粉酶时,都需要葡萄糖的诱导,且随着培养基中葡萄糖浓度的增加,酶的表达量增加。SΔcar1/A2在两种培养基中产生淀粉酶时,不需葡萄糖诱导,但SΔcar1/A2 α-淀粉酶表达受葡萄糖的反馈抑制,低浓度的葡萄糖会促进α-淀粉酶的产生,过高的葡萄糖浓度使其α-淀粉酶的表达量减少,但是在含葡萄糖的培养基中的产酶量要比在不含葡萄糖的培养基上的高。总体而言,SΔcar1/A2产α-淀粉酶和水解淀粉的能力比SΔcar1/A1的强。因此,SΔcar1/A2可被用于生料发酵,但对其在实际生产中的产酶、催化和发酵条件等则有待进一步研究。     

3株酿酒酵母发酵过程中有机酸含量变化分析

通过高效液相色谱法对3株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵过程中葡萄糖、甘油、乙醇及有机酸含量进行测定分析。结果表明:S.cerevisiae1946发酵体系中甘油和乙醇的含量显著高于S cerevisiae P1和S.cerevisiae 32788发酵体系(P0.05);3株酿酒酵母发酵液中7种有机酸存在明显的差异性和规律性;S.cerevisiae 1946发酵体系中有机酸的含量低于S.cerevisiae P1和S.cerevisiae 32788发酵体系,S cerevisiae的产酸水平与产乙醇能力呈负相关关系。     

黄酒酵母的改良及对产物中尿素和氨基甲酸乙酯含量的影响

氨基甲酸乙酯（EC)是一种潜在致癌物,在黄酒发酵过程中尿素是它的前体物质。该研究通过紫外诱变和基因过表达筛选获得改良黄酒酵母菌种,并对黄酒产品的理化指标进行检测可知,与出发菌株相比,改造菌株的发酵性能和黄酒的出酒率、酒精度、总糖、总酸、氨基酸态氮和β-苯乙醇没有明显的差异,而诱变菌株JF501-A62发酵产物尿素含量降低了67%,EC含量降低了59%;基因过表达菌株JF501-B5发酵产物尿素含量降低了88%,EC含量降低了63%。两者均有很好的发酵性能,并取得了较好地降低产品中尿素含量、进而降低氨基甲酸乙酯含量的效果。与紫外诱变相比,基因过表达的改良方法获得了尿素含量更低的菌株,并贮存6个月之后产品中的EC含量更低。     

CYS3基因的敲除及其对Saccharomyces cerevisiae3-甲硫基丙醇合成代谢的影响

研究胱硫醚γ-裂解酶基因CYS3敲除对S. cerevisiae 3-甲硫基丙醇合成代谢的影响。将编码胱硫醚-γ-裂解酶的CYS3基因和抗性标记基因Zeocin克隆,构建敲除组件CYS3Δ:Zeocin,醋酸锂法将其转化导入S. cerevisiae S288C表达,构建CYS3基因敲除的工程菌。结果表明：摇瓶发酵120 h时,工程菌S. cerevisiae C3和S. cerevisiae S288C的3-甲硫基丙醇生成量分别为0.60 g/L和0.94 g/L,S. cerevisiae C3较野生型S288C的3-甲硫基丙醇生成量降低36.2%。说明CYS3基因敲除对S. cerevisiae的3-甲硫基丙醇有较大影响,并呈现负调节作用。     

竹叶提取物和敲除转录因子DAL80对酿酒酵母精氨酸代谢的调控互作影响

以竹叶提取物为外源添加物,采用酿酒酵母DAL80敲除菌（DAL80Δ）研究添加天然产物和基因工程手段对精氨酸（arginine,Arg）代谢调控的影响。实验发现,DAL80敲除和添加竹叶提取物均能影响Arg代谢,且作用机制有所不同。敲除DAL80可提高尿素代谢相关基因（DUR1,2、DUR3、DAL82）的转录水平,以加快酿酒酵母对氨基甲酸乙酯前体物质的消耗从而抑制其形成;竹叶提取物主要通过降低酿酒酵母细胞Arg的利用率以减少尿素的合成,以此减少尿素转化为氨基甲酸乙酯。当两者同时作用时,竹叶提取物虽会削弱DAL80敲除带来的抑制影响,但DAL80敲除对酿酒酵母细胞氮代谢的影响仍占主导地位。     

ARO10基因在Saccharomyces cerevisiae中的克隆表达及其对3-甲硫基丙醇合成代谢的影响

研究了脱羧酶ARO10基因克隆与过量表达对酿酒酵母INVSc1 3-甲硫基丙醇合成途径的代谢流量影响。将脱羧酶基因ARO10与穿梭质粒pYES2连接,构建其酿酒酵母表达质粒(载体)pYES2-ARO10,LiAc/SSD-NA/PEG方法转化酿酒酵母菌株INVSc1中进行表达,验证ARO10基因过量表达对发酵产物3-甲硫基丙醇影响。结果表明,构建的酿酒酵母转化子SC10-1发酵120 h时,3-甲硫基丙醇生成量达到0.90 g/L,与未导入脱羧酶ARO10基因的对照菌株相比,3-甲硫基丙醇产量提高55.2%。因此,S.cerevisiae s288c中脱羧酶(EC 4.1.1.72)是3-甲硫基丙醇生物合成途径的关键限速酶,其增强脱羧酶基因ARO10的克隆及基因表达,有利于提高3-甲硫基丙醇的合成代谢流量。