基于荧光原位杂交法剖析窖泥微生物的预处理条件探究及应用

该研究首先对浓香型白酒窖泥样品的料液比、离心转速、超声波分散时间、Al2（SO4）3添加量等预处理条件进行优化;然后将纯培养菌体添加到窖泥样品,采用荧光原位杂交（FISH）法检测菌体回收率;最后按最优预处理条件处理不同窖龄窖池窖泥,并采用FISH法研究窖泥样品中的微生物。结果表明,窖泥样品的最优预处理条件为料液比1∶16（g∶mL）、离心转速800 r/min、超声分散时间60 s、Al2（SO4）3添加量为4.17×10-5 mol/g窖泥。在此条件下,FISH法检测大肠杆菌（Escherichia coli）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的菌体回收率分别为62.50%、55.44%,表明优化后的预处理条件对于窖泥微生物的FISH检测是可行的。FISH法检测窖泥微生物,结果显示随着窖池窖龄的增加,窖泥样品中细菌、古菌及菌体总数差异明显,总体呈现出先增加后降低的趋势,在100年窖龄的窖泥样品中,微生物总量最高。     

纯培养微生物荧光原位杂交技术检测的影响因素探究

为了研究纯培养微生物荧光原位杂交技术（FISH）检测的影响因素,该实验以大肠杆菌（Escherichia coli）及植物乳杆菌（Lactobacillus planetarium）为研究对象,研究不同种属、不同生长期菌株、菌体预处理方式及杂交条件对基于探针EUB338的FISH检测结果的影响。结果表明,菌体种类及菌体生长阶段均较明显影响FISH计数的准确性;确定超声分散菌体时间60 s（100 W、每30 s间歇）、溶菌酶处理60 min可较大幅度提高FISH对菌体的检出率;杂交时间和洗脱液中NaCl浓度对FISH检测结果影响小,杂交温度、杂交液中甲酰胺浓度对大肠杆菌影响小而对植物乳杆菌有一定影响。     

浓香型白酒窖池细菌与古菌随窖龄变化的特征

窖龄是影响浓香型白酒品质和风格的关键因素,在优化FISH (Fluorescence in situ hybridization)技术预处理条件的基础上,结合荧光显微镜的可视化信息,探究了不同窖龄浓香型白酒窖池中窖泥的细菌、古菌数量随窖龄变化的特征.结果表明,不同窖龄窖泥中细菌与古菌的数量存在显著差异(p＜0.05),随着窖龄的增长有不同程度的增加.试验窖池窖泥中细菌和古菌数量最低,分别为0.82× 109 cells/g和0.78×109 cells/g,300年窖池窖泥中细菌数量最高,为11.19×109 cells/g,100年窖池窖泥中古菌数量最高,为12.61×109 cells/g.FISH技术能较真实地反映出窖池中细菌与古菌的生长信息,为浓香型白酒窖池微生物群落结构的研究提供了一种快速、有效的检测手段.同时,窖池中微生物群落结构组成的研究,对新窖老熟工艺及名优白酒的生产均有着积极的指导意义.     

基于高通量测序的浓香型白酒窖池细菌群落结构分析

本试验利用高通量测序技术研究浓香型白酒窖池窖泥微生物群落结构,建立了一套完整的窖泥微生物群落结构研究方法和相关数据分析方法,同时得到了川北地区不同窖龄的窖泥微生物群落结构。通过Roche GS junior高通量测序平台对川北地区不同窖龄窖泥微生物群落结构进行分析后发现:6口窖池的窖泥主要细菌类群为Firmicutes(厚壁菌门)占79%,Actinobacteria(放线菌门)占4.9%、Bacteroidetes(拟杆菌门)占4.1%、Lentisphaerae(黏胶球形菌门)占3.5%、Synergistetes(互养菌门)占2.5%,其它占6%;其中Clostridiales Family XI.Incertae Sedis随着窖龄的增加呈现减少的趋势,Actinobacteria类群和Synergistetes类群随着窖龄的增加呈现增加的趋势,而Haloplasmataceae类群和Clostridiaceae类群则只在30年窖龄的窖池中有检测出,Syntrophomonadaceae类群在5年窖龄的窖池中均有检出,Lactobacillaceae类群和Porphyromonadaceae类群则只在30年窖龄的一口窖池中是优势细菌类群。     

浓香型白酒不同窖泥的微生物群落特征分析

窖泥是发酵过程微生物栖息的生态环境之一,不同窖泥中的微生物种群随窖泥生产利用年份和环境不同而呈现不同的多样性。本研究利用细菌16S rDNA的V7～V8区和产甲烷古菌16S rDNA V3区的PCR-DGGE技术,分析了不同窖泥的微生物群落特征;同时进行了部分细菌16S rDNA的V7～V8区的序列测定。结果表明,不同窖龄及不同颜色的窖泥表征出特异性的细菌与产甲烷古菌群落发育状况;UPGAMA聚类分析显示50年和150年黑色窖泥的菌群结构最为相似;序列分析表明DGGE图谱中部分条带的基因序列与基因库相似菌的相似性在82%～99%之间,其中梭菌属和未被鉴定的细菌是这些窖泥样品的优势菌。     

凤香型白酒窖泥细菌群落结构分析

窖池中的窖泥作为微生物的主要载体在白酒酿造过程中发挥着至关重要的作用。以凤香型白酒窖泥为研究对象，采用高通量测序技术结合荧光定量PCR法解析窖壁泥和窖底泥中细菌生物量、细菌群落结构及多样性。结果表明：窖泥中细菌的生物量在108～1010copies/g窖泥之间，窖底泥中细菌的生物量高于窖壁泥。窖壁泥和窖底泥中细菌群落的丰富度差异不大，结构组成存在差异。窖壁泥、窖底泥中检测的细菌种群可分别归属于34个、37个细菌门，各有4个、6个优势细菌门，其中厚壁菌门Firmicutes为绝对优势细菌门，相对丰度分别是64%、65%；可分别归属于719个、627个细菌属，各有10个、12个优势细菌属，其中乳杆菌属Lactobacillus为窖壁泥中绝对优势细菌属，相对丰度达45%,Caproiciproducens为窖底泥中第一优势细菌属，相对丰度达22%。     

不同质量窖泥细菌群落的研究

采用多聚酶链式反应结合变性梯度凝胶电泳指纹分析技术(PCR-DGGE),对不同质量窖泥中细菌群落结构进行分析,从微生物角度说明了不同质量窖泥细菌种群的复杂性,同时,鉴定出了常见的芽孢杆菌、醋酸杆菌等微生物,以及发现可能的新菌种和尚未在窖泥研究中报道的瘤胃球菌。以质量最好的窖泥为参照,其他窖泥的质量与其跟参照窖泥的细菌群落间相似性指数总体呈正相关。这一规律为今后研究窖泥培养、养护和应用提供了理论依据。     

基于PLFA分析不同窖龄窖泥微生物群落结构

该试验采用磷脂脂肪酸（PLFA）生物标记法对两种不同窖龄窖泥（30年、100年）微生物群落特征进行了研究。结果表明,100年窖龄窖泥微生物群落多样性高于30年的。对两种不同窖龄窖泥各类型的微生物结构研究发现,100年窖龄窖泥各类型的微生物含量均高于30年窖龄窖泥的,并且在两种不同窖龄窖泥中细菌的含量与丰度较其他类型微生物高,表明细菌是窖泥优势菌群。对两种不同窖龄窖泥磷脂脂肪酸含量进行主成分分析发现,30年窖龄窖泥的主要变异菌群是细菌,100年窖龄窖泥的主要变异菌群是细菌与真菌。     

不同窖龄及位置窖泥微生物群落和代谢组分的差异

基于多相检测技术探究了不同窖龄窖泥微生物群落及主要代谢组分的时空特点.结果表明,窖池微环境和代谢物间相互影响,胁迫微生物群落定向进化.Caproiciproducens和Clostridium sensu stricto 12等7种细菌与窖龄相关,产甲烷古菌则与窖泥的位置有关.此外,不锈钢代替窖泥盖,降低了窖池中Lac...     

川皖地区浓香型白酒窖底泥微生物菌群的多样性分析

以四川中部三大名优酒厂所取20年窖龄的窖底泥,以及在安徽某酒厂所取窖龄为20年的老熟、未老化和老化窖泥为研究对象.通过PCR-DGGE技术及Quantity One软件分析比对了各酒厂窖底泥的微生物群落结构.结果表明,与安徽某酒厂相比,四川3个酒厂的细菌群落结构极为相似,而各酒厂古菌菌群的差异较大;安徽某酒厂老化窖泥与其老熟及未老化窖泥相比,细菌和古菌菌群在数量和丰度上都有所降低,但是都有明显的优势菌存在.     

Characterization of archaeal community in Luzhou‐flavour pit mud

The aim of this study was to investigate the archaeal community in different ages of pit mud by a combined fluorescence in situ hybridization (FISH) and polymerase chain reaction–denaturing gradient gel electrophoresis (PCR‐DGGE) method. Four probes were used to detect the major methanogenic archaea by FISH experiments, and the results showed that orders Methanosarcinales, Methanobacteriales, Methanomicrobiales and Methanococcales were detected in the various ages (50, 100 and 300 year) of pit mud, except for the 1 year‐old pit and the 100 year‐old sample, which exhibited the highest numbers of archaea. The amounts of the four methanogenic archaea significantly increased from the 50 to 100 year‐old pit mud and slightly decreased in the 300 year‐old pit mud. Results of PCR‐DGGE analysis suggest that all archaeal 16S rRNA gene sequences fall into the phylum Euryarchaeota, and Methanobacteriales and Methanomicrobiales dominated in low‐age (1 and 50 year) and old age (100 and 300 year) of pit mud, respectively. Analysis of the community diversity based on the DGGE profiles showed that the 100 and 300 year samples exhibited similar diversity indices compared with the 1 and 50 year samples. This is the first report about the archaeal community structure in different ages of pit mud determined by both FISH and PCR‐DGGE analysis. Copyright © 2015 The Institute of Brewing & Distilling     

水井坊窖底泥微生物群落结构的DGGE分析

为了补充和验证研究浓香型白酒不同窖泥的微生物群落特征分析,该研究采用DGGE技术对水井坊酒厂窖龄分别为50及150年相同窖池不同部位窖底泥（三点取样法）进行细菌、古菌和真菌微生物群落特征分析。研究结果显示：50年和150年窖龄窖泥的微生物群落的演替特征和分布特征具有一定相似性,进一步验证了50年可能是窖池微生态发生较大变化的一个分界线这一推测的准确性;不同部位的窖底泥的微生物群落结构具有一定的差异性,因此在今后对窖底泥的实验研究中,采用多点取样法进行分析。     

窖泥及窖泥功能菌液微生物群落的研究进展与发展趋势

通过窖泥微生物群落、窖泥功能菌液微生物群落研究进展的分析,对窖泥及窖泥功能菌液微生物群落研究发展趋势进行了预测,提出理论研究与应用研究相结合、纯培养与免培养技术相结合、纯培养与免培养技术进步等观点,为窖泥微生物有效的人工动态调控提供理论依据。     

应用PCR-DGGE技术分析不同性状窖泥的细菌群落结构

基于聚合酶链式反应-变性梯度凝胶（PCR-DGGE）技术分析了不同性状窖泥的细菌群落DGGE指纹图谱,结果表明,通过DGGE指纹图谱能够区分新窖泥、窖壁泥和窖底泥,其中以窖壁泥退化前后图谱变化最明显。PCR-DGGE图谱优势条带测序结果显示,窖泥中细菌微生物包括拟杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、变形菌门4类,其中新窖泥微生物种类最丰富,涵盖以上门类,特有优势微生物为Enterobacterale科、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）及里氏杆菌属（Riemerella）。紫单孢菌科（Porphyromonadaceae）仅存在于窖底泥中,Tumebacillus属微生物只存在于窑壁泥中。通过窖泥的DGGE图谱对比分析,能够对窖泥类型做出初步判定,并能及时发现窖泥退化现象,为工厂窖泥培养、检测和窖泥优化提供了理论支持。     

基于Biolog ECO技术分离窖泥细菌的研究

根据窖泥微生物的特性和生长特点,模拟窖泥的微生态环境以不同的培养基和培养条件对微生物进行分离、纯化,用Biolog微生物鉴定系统鉴定,确定窖泥微生物各种菌株.结果显示,细菌含有几大类群,表现出高度的细菌多样性.主要为芽孢杆菌属（Bacillus）、芽孢乳杆菌属（Sporolactobacillus）类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、诺卡氏菌属（Nocardia）、梭菌属（Clostridium）、棒状杆菌属（Corynebacterium）.     

浓香习酒窖泥微生物菌群多样性及系统发育分析

窖池窖泥中微生物的分类鉴定对于分析窖泥的时间长短及其对酒的香味和风味影响发挥着非常重要的作用。运用多种微生物分子生态学技术手段对习酒酿酒窖泥细菌进行研究分析,结果表明,夏季老窖多粮窖壁泥中的细菌主要分为4个菌群:Petrimonas sulfuriphila,Thermacetogenium phaeum,Caloramator及不可培养的杆菌属;古菌主要分为2个簇:Methanoculleus和Methanoculleus palmolei。所有细菌都是厌氧的且大多数是嗜热或嗜温的,窖泥中细菌和古菌共同作用生成多种活性物质降解复杂的有机物,其代谢产物在窖池特定的环境中通过复杂的生理生化反应能形成浓香型白酒的特征风味因子。