乙醇胁迫对植物乳杆菌D5-5代谢活力的影响

以(Lactobacillus plantarum D5-5)为研究对象,用不同体积分数乙醇胁迫菌体,测定乙醇胁迫后菌体中乳酸脱氢酶(LDH)、ATP酶的活力,胞外β-半乳糖苷酶相对酶活及细胞膜特性的变化,分析乙醇胁迫后造成菌体失活的主要因素,探讨乙醇胁迫对乳酸杆菌的损伤机制。结果表明:在乙醇体积分数为6%~8%胁迫条件下,菌体存活率分别降低了44.07%、61.81%、69.79%,乙醇胁迫对植物乳杆菌D5-5LDH、ATP酶具有显著影响,胞外β-半乳糖苷酶相对酶活升高,细胞膜完整性和表面结构受破坏程度增强。说明LDH、ATP酶是影响乙醇胁迫损伤的关键酶,乙醇胁迫致使菌体关键酶失活,细胞膜完整性破坏,细胞表面结构受损,从而影响植物乳杆菌D5-5的正常生理代谢。     

乙醇胁迫对乳酸杆菌关键酶活力的影响

分别以面包乳杆菌(Lactobacillus crustorum D2-5)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum D5-5)为研究对象,进行不同乙醇体积分数胁迫后菌体活力的对比,测定了乙醇胁迫后菌体中己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脱氢酶(LDH)及ATP酶的活力变化,分析了乙醇胁迫后造成菌体失活的主要因素。结果表明:5%乙醇胁迫处理有助于提高菌体存活率,但是效果不显著;8%乙醇胁迫后的菌体存活率明显降低,面包乳杆菌D2-5和植物乳杆菌D5-5存活率依次仅为26.61%和23.50%,菌体的生长受到严重抑制,致使相关酶活力降低。乙醇胁迫对乳酸杆菌己糖激酶影响不显著,对其丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶及ATP酶具有极显著的影响。这一结果说明,丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶及ATP酶是影响乙醇胁迫损失的关键酶,酶活力变化与菌体活力相关。     

益生菌制剂对抗生素诱导腹泻模型小鼠肠道菌群的恢复

本论文采用肠上皮细胞模型HT-29细胞系研究8株植物乳杆菌在HT-29细胞上的黏附性,并研究黏附性较强的菌株及其胞外多糖（ExopolySaccharides,EPS）抑制大肠杆菌(E?coliATCC25922)在HT-29细胞上黏附及刺激HT-29细胞产生炎性因子的作用。结果表明8株植物乳杆菌在HT-29细胞上的黏附性差异较大：黏附性最强的植物乳杆菌35通过取代、竞争和排阻方式抑制大肠杆菌在HT-29细胞上黏附,抑制黏附率分别为30%、33%和59%,其EPS在作用浓度为500 μg/mL时对大肠杆菌的抑制黏附率为32%。植物乳杆菌35可抑制大肠杆菌刺激HT-29细胞产生IL-8,通过取代、竞争、排阻方式抑制大肠杆菌刺激HT-29细胞产生IL-8,抑制率分别为3%、28%和40%;其EPS抑制大肠杆菌刺激HT-29细胞产生IL-8具有浓度效应,浓度为500 μg/mL时抑制率最高,为50%。而对于IL-10表达量的影响均不显著。结果表明植物乳杆菌35具有抑制大肠杆菌引起肠炎的潜在益生功能。     

植物乳杆菌35对大肠杆菌在肠上皮细胞HT-29上黏附及刺激产生促炎细胞因子的影响

本论文采用肠上皮细胞模型HT-29细胞系研究8株植物乳杆菌在HT-29细胞上的黏附性,并研究黏附性较强的菌株及其胞外多糖(Exopoly Saccharides,EPS)抑制大肠杆菌(E.coli ATCC25922)在HT-29细胞上黏附及刺激HT-29细胞产生炎性因子的作用。结果表明8株植物乳杆菌在HT-29细胞上的黏附性差异较大:黏附性最强的植物乳杆菌35通过取代、竞争和排阻方式抑制大肠杆菌在HT-29细胞上黏附,抑制黏附率分别为30%、33%和59%,其EPS在作用浓度为500μg/mL时对大肠杆菌的抑制黏附率为32%。植物乳杆菌35可抑制大肠杆菌刺激HT-29细胞产生IL-8,通过取代、竞争、排阻方式抑制大肠杆菌刺激HT-29细胞产生IL-8,抑制率分别为3%、28%和40%;其EPS抑制大肠杆菌刺激HT-29细胞产生IL-8具有浓度效应,浓度为500μg/mL时抑制率最高,为50%。而对于IL-10表达量的影响均不显著。结果表明植物乳杆菌35具有抑制大肠杆菌引起肠炎的潜在益生功能。     

具有保护肠上皮细胞HT-29免受大肠杆菌和H2O2损伤潜力的植物乳杆菌的筛选

益生菌可在肠道定植从而发挥抗炎或抗氧化活性,有利于宿主肠道健康.本实验研究了从新疆传统发酵乳制品中分离得到的8株植物乳杆菌对大肠杆菌侵袭和过氧化氢刺激肠上皮细胞HT-29的保护作用.结果表明:在8株植物乳杆菌中,植物乳杆菌35具有最高的黏附能力.植物乳杆菌35可通过取代、竞争、排阻的方式抑制大肠杆菌对HT-29细胞的黏...     

抗生素环丙沙星胁迫植物乳杆菌ZLC-18应激反应的研究

本研究采用0.1、0.5、2.0 μg/mL的环丙沙星作为实验药物,通过研究环丙沙星主动胁迫下肠道内植物乳杆菌产生的应激反应,为开发一类具有抵御抗生素胁迫能力、保持肠道菌群微生态平衡的益生菌制剂提供理论依据。结果表明,环丙沙星胁迫下,植物乳杆菌菌体存活率整体呈下降趋势,且菌体存活率随环丙沙星浓度增大而降低;观察菌体细胞膜完整性发现,细胞膜受损程度与环丙沙星浓度呈正相关;测定菌体侧向扩散速率来反映其细胞膜流动性,结果显示,2.0 μg/mL的环丙沙星会使菌体细胞膜流动性极显著降低(P<0.01),与对照组相比降低了39.93%;菌体超微结构观察发现,环丙沙星会明显改变植物乳杆菌的菌体形态,严重时可造成细胞质外泄,甚至导致细胞死亡;菌体糖代谢关键酶活力结果表明,2.0 μg/mL环丙沙星处理后的己糖激酶、丙酮酸激酶及乳酸脱氢酶酶活力均极显著下降(P<0.01),而经0.5 μg/mL环丙沙星胁迫后,与对照组乳酸脱氢酶酶活(0.069±0.002)U/mg prot相比,其乳酸脱氢酶活力反而增加,酶活为(0.081±0.006)U/mg prot(P<0.01);反复用质量浓度为0.5 μg/mL的环丙沙星胁迫菌体后,其乳酸脱氢酶酶活为(0.126±0.004)U/mg prot(P<0.01)。说明在低浓度环丙沙星的胁迫下,植物乳杆菌会产生应激胁迫响应,启动自我保护机制,抵御抗生素不良胁迫,这为肠道益生菌制剂开发提供了重要的技术支撑。     

类植物乳杆菌L-ZS9黏附特性研究及胃肠道环境对其黏附力的影响

为评价类植物乳杆菌L-ZS9的黏附特性及胃肠道环境对其黏附力的影响,以HT-29细胞为黏附模型,测定类植物乳杆菌L-ZS9的黏附率,考察菌株的表面疏水性、自聚集能力;以胰蛋白酶、牛血清白蛋白、过碘酸钠处理菌株,分析类植物乳杆菌L-ZS9的黏附素类型;进一步在体外模拟胃肠道环境,考察胃肠道环境对类植物乳杆菌L-ZS9黏附能力的影响。整个研究以黏附力较高的益生菌鼠李糖乳杆菌LGG作为阳性对照菌株。研究结果表明:L-ZS9的黏附率为23.33%、表面疏水率为49.86%,静置2 h自聚集百分比为2.63%,显著高于对照菌株鼠李糖乳杆菌LGG。过碘酸钠处理对L-ZS9的黏附能力没有影响,牛血清白蛋白和胰蛋白酶处理使菌株黏附数分别从927个细菌/100个细胞降低到244个细菌/100个细胞和211个细菌/100个细胞。表明脂磷壁酸和菌体表面蛋白是L-ZS9的主要黏附因子。经过胃肠道逆环境处理后,类植物乳杆菌L-ZS9的黏附数从4.06×108 cfu/m L降低到3×106 cfu/m L,但高于经过相同处理的鼠李糖乳杆菌LGG。研究结果证明类植物乳杆菌L-ZS9是一株具有强黏附能力的潜在益生菌。     

嗜酸乳杆菌S-层蛋白对肠道细胞黏附及巨噬细胞增殖的影响

比较去除S-层蛋白前后嗜酸乳杆菌对肠道细胞黏附及菌体自我凝集率的变化,并探究S-层蛋白对巨噬细胞增殖及溶酶体分泌的影响。采用4M氯化锂提取嗜酸乳杆菌ATCC 4356的表层蛋白,经透析及微孔过滤等步骤得到S-层蛋白,SDS-PAGE确定其分子量。利用酶标仪测定嗜酸乳杆菌在37℃孵育过程中(0 h~5.5 h)自我凝集率的变化情况,光学显微镜观察去除S-层蛋白前后嗜酸乳杆菌对结肠癌细胞HT-29的黏附情况变化。将S-层蛋白与巨噬细胞RAW264.7孵育2 h后,MTS法测定细胞增殖情况,并采用溶酶体荧光探针研究溶酶体分泌量的变化。结果表明:所提蛋白为嗜酸乳杆菌S-层蛋白(分子量M≈46ku)。嗜酸乳杆菌自我凝集率随孵育时间的延长而呈现出上升趋势,去除S-层蛋白后,菌体自我凝集率降低,嗜酸乳杆菌对HT-29细胞的黏附量也明显减少,且S-层蛋白能促进巨噬细胞增殖及其溶酶体分泌。     

真空低温喷雾干燥制备乳双歧杆菌Probio-M8微胶囊

目的：采用真空低温喷雾干燥制备乳双歧杆菌Probio-M8微胶囊。方法：通过单因素试验、正交试验及Box-Behnken响应面试验确定最佳工艺条件,采用气相色谱法检测干燥前、后菌体细胞膜脂肪酸组分变化,并用流式细胞仪观测干燥前、后菌体细胞膜完整性的变化;采用扫描电镜观察微胶囊粉的形态结构以及使用差示扫描量热仪测定微胶囊粉的玻璃化转变温度。结果：最佳的喷雾条件：进风温度80 ℃、进料速度9 mL/min、喷头直径1.5 mm。最佳复配保护剂配方：脱脂乳添加量13%、麦芽糊精10%、谷氨酸钠7%。在最佳工艺条件下生产的Probio-M8微胶囊存活率为78.34%。其结构完整,常温下处于玻璃态,菌体细胞膜的完整性也显著提高,干燥后菌体细胞膜脂肪酸的UFA/SFA比值提高了0.44,稳定了细胞膜的流动性。结论：通过优化工艺条件,显著地维持了菌体的生物活性,为生产乳双歧杆菌Probio-M8微胶囊提供了一种低能耗、高活性的技术方案。     

酸-冷交互胁迫对保护冷冻干燥发酵乳杆菌活性的作用

为探究酸-冷交互胁迫对冷冻干燥发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)ATm的影响,考察酸-冷交互胁迫的处理方式对细胞存活率、滞后时间以及酸化速率的影响,同时测定交互胁迫对乳酸脱氢酶、ATP酶活性以及细胞膜完整性的影响。结果表明,pH 4.5、4℃酸-冷交互胁迫能够显著提高细胞冷冻干燥存活率及酸化速率,其中冷冻干燥存活率能够达到87.19%,优于单因素胁迫;pH 4.5、4℃酸-冷交互胁迫能够提高发酵乳杆菌ATm的冷冻干燥存活率保护其活性,提高酶活性,维持细胞膜完整性。     

营养胁迫植物乳杆菌KLDS 1.0328的生理特性及其冷冻干燥菌粉贮存稳定性分析

为探究冷冻干燥植物乳杆菌KLDS 1.0328的贮存稳定性受初始营养条件调控的差异性,分析葡萄糖胁迫、吐温80胁迫以及葡萄糖和吐温80复合胁迫对该菌株生长、产酸、细菌素抑菌活性、形态、细胞膜脂肪酸和菌粉贮藏过程中存活率的影响。研究发现,葡萄糖和吐温80胁迫对菌体的生长、产酸和细菌素的产生有不同程度的影响。扫描电镜结果显示,吐温80胁迫或葡萄糖和吐温80复合营养胁迫环境下,菌体由短杆状转变为长棒状或卵圆形,尺寸也随之增大或减小。经多种营养胁迫处理后,各处理组中菌体细胞膜的不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸含量比值均有所提高。此外,葡萄糖胁迫可显著提高冷冻干燥植物乳杆菌KLDS 1.0328在－18 ℃贮存42 d期间的稳定性和存活率。     

具有α-葡萄糖苷酶抑制作用益生菌的筛选及特性分析

以实验室77 株益生菌为研究对象,从其菌体细胞代谢物（cell-free excretory supernatants,CFS）和细胞内容物（cell-free extracts,CFE）两方面分析菌株对α-葡萄糖苷酶的抑制活性;同时还从耐酸性、细胞黏附性等方面对具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的菌株进行了益生特性评价;最后利用主成分分析进行综合性评价,以期筛选出具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的益生菌。结果表明,77?株益生菌的CFE对α-葡萄糖苷酶没有抑制作用;而CFS对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用,抑制率为2.53%～15.76%。选取抑制率明显高于其他益生菌（编号为ST-2、1.1881、GS-3和BLP12）菌株进行益生特性的研究。其中ST-2表现出很高的耐酸性和细胞黏附性;GS-3在模拟消化液中有很强的耐受性等,各菌株特性不一。主成分分析表明菌株BLP12的综合性能最好：其对α-葡萄糖苷酶的抑制率可达15.10%;于pH?2.0孵育3?h后,存活率能达到71.04%;于2.0%的胆盐条件下孵育24?h,存活率为0.70%;依次经模拟唾液、胃液、肠液消化后,存活率仍能达到88.27%,但对HT-29细胞的黏附率较低,仅为1.93%,总体上菌株BLP12对体外模拟胃肠环境的适应性很强。该菌株经过16S基因序列鉴定为植物乳杆菌,可作为降糖益生菌株应用于降糖食品的开发。     

可降胆固醇的优势乳杆菌筛选

为丰富降胆固醇、降血糖的益生菌资源,以实验室10株潜力益生菌株为实验对象,进行体外降胆固醇能力、胆盐水解酶(BSH)活性及α-葡萄糖苷酶抑制率试验,测定菌株对人工胃液和胆盐的耐受性,评价优势菌株的细胞黏附性能及对抗生素的耐药安全性能。结果表明,植物乳杆菌LH-511、植物乳杆菌10-12、植物乳杆菌10-4对胆固醇的降解率在50%以上,显著高于商业菌株植物乳杆菌299V(p<0.05)。植物乳杆菌10-12、植物乳杆菌SD-H9对α-葡萄糖苷酶的抑制率高达41.7%、40.1%。植物乳杆菌LH-511、植物乳杆菌10-12、植物乳杆菌10-4、植物乳杆菌10-14、卷曲乳杆菌OF48-2pH5这5株菌具有较好的BSH活力、α-葡萄糖苷酶抑制性、抗逆性以及对HT-29细胞的黏附能力。但仅植物乳杆菌LH-511和卷曲乳杆菌OF48-2pH5通过了10种抗生素的安全性试验。综上所述,植物乳杆菌LH-511和卷曲乳杆菌OF48-2pH5具有较好的降胆固醇、降血糖潜力,且通过了抗逆性、黏附性、安全性试验,可用于进一步的开发和应用。     

一株具降胆固醇功能的海洋源植物乳杆菌的筛选及其益生性能分析

本文采用邻苯二甲醛法从喙鲸内脏中筛选分离出一株高效降胆固醇能力的乳酸菌HJ-S2,考察并研究了乳酸菌HJ-S2的体外益生性能。通过耐酸、耐胆盐测定菌株的益生作用,研究了其对致病菌的抑菌作用及对人结肠癌细胞HT-29的粘附能力,利用形态学、API50CH和16S rDNA对菌株进行鉴定。乳酸菌HJ-S2体外降胆固醇能力达到48.82%,在p H值3的酸性环境中培养3h耐受率达到82.73%,在含0.3%的胆盐环境中培养3 h耐受率达80.62%。菌株代谢物对致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均有一定的抑菌作用,且菌株对人结肠癌细胞HT-29很强的粘附能力,粘附细菌数为132.52,经鉴定为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum,并命名为HJ-S2(CGMCCNO:17720)。筛选得到的植物乳杆菌HJ-S2体外具有高效降胆固醇能力,可进一步开发为功能性微生态制剂。     

火龙果籽油抑制癌细胞增殖作用的研究

采用气相-质谱联用仪(GC-MS)分析了火龙果籽油的脂肪酸组成;利用噻唑蓝(MTT)法,检测了火龙果籽油抑制Hep G-2、HT-29人体癌细胞的增殖,并绘制了火龙果籽油对这些癌细胞生长曲线的影响。结果表明:火龙果籽油中主要含有亚油酸(41.28%)、油酸(26.17%)、棕榈酸(20.76%)等组分,不饱和脂肪酸高达72.10%;MTT法显示火龙果籽油呈剂量(1、3、5 mg/m L)和时间(24、48、72、96 h)依赖方式抑制Hep G-2、HT-29等细胞增殖,作用48 h细胞抑制率分别可达到24.76%、38.92%、48.18%和35.47%、46.11%、53.78%,火龙果籽油对这些癌细胞的生长具有显著性、持续性的抑制作用。     

唾液乳杆菌CCFM 1054通过改变肠道菌群缓解空肠弯曲杆菌在小鼠体内的感染

考察了唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)CCFM 1054体外培养产酸及发酵上清液抑制空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)生长能力、对人工模拟胃肠液中的耐受、对共培养条件下的抑菌能力、对HT-29细胞的粘附以及自我形成生物膜的能力,并以鼠李糖乳杆菌LGG和植物乳杆菌N49作为对比菌株,分别干预空肠弯曲杆菌和弓形虫复合感染的小鼠。结果显示,CCFM 1054能显著改变小鼠肠道菌群的组成,降低空肠弯曲杆菌在小鼠体内的定植率并缓解其感染。肠道菌群变化和乳酸菌拮抗空肠弯曲杆菌相关的体内外特性的相关性分析表明,CCFM 1054对细胞的高粘附性及其较强的生物膜形成能力使得其能在小鼠体内显著改变肠道菌群丰度。     

Pulsed electric fields cause bacterial envelopes permeabilization depending on the treatment intensity, the treatment medium pH and the microorganism investigated

The relationship between membrane permeabilization and loss of viability by pulsed electric fields (PEF) depending on the treatment intensity and the treatment media pH in two gram-positive (Lactobacillus plantarum, Listeria monocytogenes) and two gram-negative (Escherichia coli, Salmonella senftenberg 775W) bacterial species has been investigated. Loss of membrane integrity was measured as increased uptake of the fluorescent dye propidium iodide (PI). Non-permanent/reversible permeabilization was detected when cells stained with PI during PEF resulted in higher fluorescence than that measured in cells stained after PEF. Whereas loss of viability of the two gram-negative bacteria was correlated with the sum of non-permanent and permanent membrane permeabilization when treated at pH 7.0, in the case of the two gram-positives, loss of viability was correlated with a permanent loss of membrane integrity. At pH 7.0, the four bacteria exhibited reversible permeabilization. However, whereas the gram-positives capable of reversing permeabilization survived, the gram-negative cells died, despite their capacity to reverse permeabilization immediately after PEF. Thus, resealing is not necessarily related to the survival of PEF-treated cells. In contrast, when cells were PEF-treated at pH 4.0 a more complicated picture emerged. Whereas loss of viability was correlated with a permanent loss of membrane integrity in L. monocytogenes cells, in L. plantarum the degree of permeabilization was higher, and in the gram-negative strains, much lower than the percentage of inactivated cells. These results support the view that membrane permeabilization is involved in the mechanism of bacterial inactivation by PEF, but the nature of membrane damage and its relationship with cell death depends on the bacterial species and the treatment medium pH.     

Fermented nondigestible fraction from common bean (Phaseolus vulgaris L.) cultivar Negro 8025 modulates HT-29 cell behavior

The aim of the study was to evaluate the effect of a fermented nondigestible fraction (FNDF) of cooked bean (Phaseolus vulgaris L.) cultivar Negro 8025 on human colon adenocarcinoma HT-29 cell survival. Negro 8025 was chosen for in vitro fermentation based on comparison of chemical composition with 2 other cultivars: Azufrado Higuera and Pinto Durango. Negro 8025 had 58% total dietary fiber, 27% resistant starch, and 20 mg of (+)-catechin equivalents per gram of sample. Short-chain fatty acids (SCFAs) production and pH of the medium were measured after fermentation as indicators of colon protection through induced arrest on cell culture and apoptosis. Butyrate and pH of FNDF of Negro 8025 were higher than the control fermented raffinose extract. The FNDF inhibited HT-29 cell survival in a time- and concentration-dependent manner. The lethal concentration 50 (LC(50)) was 13.63% FNDF (equivalent to 7.36, 0.33, and 3.31 mmol of acetic, propionic, and butyric acids, respectively). DNA fragmentation, an apoptosis indicator, was detected by the TdT-mediated dUTP nick end labeling method in cells treated with the LC(50)-FNDF and a synthetic mixture of SCFAs mimicking LC(50)-FNDF. Our results suggest that common bean is a reliable source of fermentable substrates in colon, producing compounds with potential chemoprotective effect on HT-29 colon adenocarcinoma cells, so it may present an effective alternative to mitigate colon cancer development.