产β-葡聚糖酶耐盐鲁氏酵母的筛选及鉴定

从农家自制辣椒酱中分离纯化了一株耐盐酵母,通过β-1,3葡聚糖酶鉴定(刚果红染色法)确定其具有合成、分泌胞外β-1,3葡聚糖酶特性。Na Cl耐受性研究确定其具有高耐盐性,能经144 h的适应期后在24%Na Cl的培养基B中稳定生长120 h。经26s r RNA基因序列分析鉴定为鲁氏酵母A(Z.Rouxii A)。Z.Rouxii A发酵培养中存在二次生长现象,其生物量在24 h和48 h达到峰值,分别比18 h的6.38 g/L提高了46.55%和87.15%,而21 h后葡萄糖浓度仅维持在1.57 g/L左右,说明:Z.Rouxii A生长过程中合成、分泌的β-葡聚糖酶持续降解发酵培养基中添加的β-1,3-1,6-葡聚糖,为其二次生长提供了碳源和能源。Z.Rouxii A的β-1,3-葡聚糖酶活性曲线与生长曲线基本趋势一致,最大酶活性随着菌体自溶(12 h、24 h和48 h)而迅速降低,48 h达到酶活峰值15.23 U/m L,说明:Z.Rouxii A的β-1,3-葡聚糖酶合成与细胞生长偶联。以上数据确认该菌为产β-葡聚糖酶高耐盐鲁氏酵母。     

特基拉芽孢杆菌来源β-1,3-1,4-葡聚糖酶重组菌发酵培养基的优化

为了提高重组大肠杆菌(Escherichia coli BL21DE3)(pET-28a(+)-bgl)发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的能力,研究了发酵培养基中各类碳源及氮源的影响,并通过响应面分析法优化培养基各组分的含量。结果表明,甘油为最适碳源,酵母粉及胰蛋白胨为氮源。优化的培养基组成是:yeast extract终浓度为20 g/L,胰蛋白胨12.5 g/L,甘油14.1 mL/L,KH2PO42.17 g/L,K2HPO42.74 g/L。三角瓶发酵产β-葡聚糖酶酶活(2 978.2 U/mL),与初始培养基(1 671.9 U/mL)相比,提高了1.78倍。研究结果表明,发酵培养基的优化对重组大肠杆菌发酵生产工业酶具有重要作用。     

基因突变提高毕赤酵母表达内切β-1,3-葡聚糖酶活性

为构建一株高效表达内切β-1,3-葡聚糖酶的毕赤酵母菌株,并用于水解热凝胶生产β-1,3-葡寡糖。作者首先对哈茨木霉来源内切β-1,3-葡聚糖酶基因进行随机突变,并构建BGN13.1a突变库;然后采用高通量技术及刚果红平板筛选高表达菌株;最后采用TLC薄层色谱和MALDI-TOF MS分析热凝胶水解产物,并分析了酶学性质。结果表明,本研究成功筛选得到毕赤酵母突变株K827,酶活较初始菌株提高了25%;其水解产物聚合度为2～10,且寡糖产量为1.492 g/L;其最适pH与最适温度分别为5.5和50℃;相较亲本酶,突变株K827的pH稳定性与温度稳定性都有明显提高。本研究为内切β-1,3-葡聚糖酶的工业化生产及应用提供依据。     

指数补料发酵提高鲁氏酵母β-1,3-葡聚糖酶产量

高耐盐鲁氏酵母A菌株(耐24%盐)10 L发酵罐产β-1,3-葡聚糖酶的过程中,葡萄糖(YEPD)是鲁氏酵母A生长和产酶的最适碳源,其发酵效率显著高于甘油(YEPG)和乙醇(YEPE),而乙酸钠的可利用性较差。YEPD批培养生长效率(生物量)、最大酶活力以及酶产率分别比YEPG和YEPE批培养提高了1.89%和29.88%、114%和19.65%以及188%和33%。与YEPD批培养相比,15~23 h开始指数流加YEPF培养基,达到最大生物量的周期缩短12 h,最大生物量提高19.29%,而且β-1,3葡聚糖酶几乎以对数增长的方式提前6 h合成到最大酶活力(44.99 U/m L),酶产率提高了76.86%,达到2.14 U/(m L·h),实现了指数补料发酵的目的。研究结果确定了有效提高鲁氏酵母A生物量和β-1,3-葡聚糖酶产量的指数补料模型,为高耐盐鲁氏酵母菌剂和β-1,3-葡聚糖酶产品有效生产以及其在高活性酿造功能食品行业的应用打下了基础。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的克隆与表达

β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶是一类专一性降解β-1,3-1,4-葡糖苷键中的β-1,4-糖苷键,产生小分子还原糖的水解酶,广泛应用于啤酒工业和饲料工业中.本研究根据毕赤酵母密码子偏好性优化β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列,采用PCR法将其插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,经Sac I线性化后电击整合入毕赤酵母X-33基因组,构建重组酵母;经菌落PCR验证和摇瓶筛选,获得一株X-33/pPICZαA-bgl,甲醇诱导96h后,酶活力达308.5U/mL,经SDS-PAGE电泳,实际蛋白分子量约为33ku.β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶最适反应pH为5.0,最适反应温度为50℃.     

重组毕赤酵母发酵生产α-葡聚糖酶的放大研究

研究了毕赤酵母高密度发酵组成型表达α-葡聚糖酶,从6.8 L发酵罐逐级放大至5000 L发酵罐的放大工艺。采用恒定p H和控制甘油残留浓度和溶解氧相结合的调控策略,进行了多批次的发酵试验。结果表明:三磷酸甘油醛脱氢酶启动子驱动的α-葡聚糖酶的生成具有生长偶联特征,集中在对数生长期和稳定期。6.8 L发酵罐中上清酶活达1253 U/m L,中试放大至50 L发酵罐中产酶最高达1300 U/m L,500 L发酵罐中酶活为740 U/m L。5000 L规模发酵罐中产酶达到589 U/m L。建立了以甘油作为碳源,发酵调控简单的工艺,避免了使用甲醇带来的安全问题,适合放大生产。     

氮源对裂褶菌产裂褶多糖和β-1,3-葡聚糖酶的影响

本论文初步探讨了利用裂褶菌发酵体系所产的内切β-1,3-葡聚糖酶对发酵产生的裂褶多糖进行适度酶解,以获得分子量适中溶解度较好的裂褶多糖的可能性。以裂褶多糖产量和β-1,3-葡聚糖内切酶和总酶活为考察指标,采用刚果红琼脂染色法和摇瓶培养,从四株裂褶菌GIM5.42、GIM5.43、GIM5.44、Sc1中筛选出多糖产量和酶活都相对较高的菌株GIM5.43,多糖产量和酶活分别为2.29g/L与0.28 U/m L。在摇瓶中考察了氮源及其添加方式对裂褶菌菌体生长、裂褶多糖产率、β-1,3-葡聚糖酶的酶活及其影响规律。结果表明:菌体生长及其分泌胞外多糖和葡聚糖酶的最适酵母浸膏和氯化铵的添加时间和添加量是不同的。为了保证多糖产率,采用分批补加策略,初始酵母浸膏浓度1.00 g/L,发酵第6 d补加0.10 g/L酵母浸膏,多糖产量为4.16 g/L,比未优化提高了61.24%,总酶活为0.34 U/m L,提高了142.86%。     

毕赤酵母工程菌产乳糖酶发酵条件优化的研究

目的优化毕赤酵母工程菌株VGal3186的发酵条件。方法对发酵培养基中的碳源、氮源、金属离子和p H、温度、接种量等发酵条件分别进行了单因素和正交试验优化,并在50 L发酵罐中验证。还对所产重组米曲霉乳糖酶进行酶学性质研究。结果优化后的发酵培养基为葡萄糖45 g/L、甘油15 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母提取物20 g/L、KH_2PO_4 4 g/L、MgSO_4 9 g/L、CaCl_2 0.5 g/L、FeSO_4 90 mg/L、CuSO_4 6 mg/L、K_2SO_4 18.2 g/L,发酵条件为p H 7.0、发酵温度30℃、接种量7%,转速300 r/min。摇瓶发酵酶活性可达689 U/m L,较优化前提高了35.2%。50 L发酵罐中酶活性可达5264 U/m L,酶学性质表现更好。结论毕赤酵母工程菌株VGal3186经发酵优化后产量更高,产乳糖酶酶学性质好,在食品工业中应用潜力巨大。     

毕赤酵母中内切β-1,4葡聚糖酶的表达及共培养制备低分子质量黄原胶

低分子质量黄原胶具有抑菌、益生及抗氧化等多种生物活性，因此通过水解制备低分子质量黄原胶具有广阔应用前景。该研究将来源于绵羊瘤胃元基因组的内切β-1,4-葡聚糖酶首次在毕赤酵母中表达，其在pH 7.0和75℃下发挥最佳作用，并有较高的pH和温度稳定性。此后，建立了毕赤酵母和野油菜黄单胞菌的共培养体系并对发酵条件进行优化，其中野油菜黄单胞菌生成的黄原胶可以被毕赤酵母分泌的内切β-1,4-葡聚糖酶直接降解产生低分子质量黄原胶。摇瓶水平下，共培养体系中总糖最高为11.4 g/L,水解产物中重均分子质量为2 500 Da的低分子质量黄原胶达到93.79%。该研究为功能性低分子质量黄原胶的工业化生产提供了一个潜在的策略。     

发酵后期补加2种氮源对克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇的影响

为探寻解决重要平台化合物1,3-丙二醇发酵后期菌体生长和1,3-丙二醇合成受限的方法,通过从菌体量、产物和关键酶活性及基因转录水平等方面,较全面地考察了发酵后期补加酵母膏和硫酸铵对克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)合成1,3-丙二醇的影响,结果为:添加两种氮源均有利于菌体生长;补加10 g/L酵母膏和硫酸铵,1,3-丙二醇产量由58.6 g/L分别提高到70.6 g/L和77.2 g/L;相对于酵母膏,硫酸铵对关键酶活性的增强更为明显,并使甘油脱氢酶(glycerol dehydrogenase,Dha D)在发酵后期始终维持较高水平,促进细胞生长和产物合成。此外,与补加酵母膏相比,补加硫酸铵后关键酶基因转录水平上调并不显著。表明硫酸铵主要通过直接激活关键酶活性促进细胞生长和产物合成。综上所述,发酵后期补加硫酸铵更利于1,3-丙二醇的生物合成,是提高发酵合成1,3-丙二醇水平的有效方式之一。     

用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达重组 猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂

目的构建组成型表达重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂(kiwi pectin methylesterase inhibitor, kwPMEI)的毕赤酵母(P．pastoris)GS115工程菌株,探索碳源(葡萄糖、甘油、甲醇)对重组菌表达kwPMEI的影响,纯化kwPMEI并鉴定其对番茄果胶酶的抑制活性。方法应用PCR方法从P．pastoris GS115染色体中扩增了三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP),以其取代诱导型表达载体pPIC9K-kwPMEI上的醇氧化酶启动子(pAOX1),构建了组成型表达载体pGAP9K-kwPMEI,并转化至GS115中。用Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析目的蛋白表达情况,镍柱亲和层析纯化目的蛋白,并用凝胶扩散方法鉴定其抑制活性。结果重组毕赤酵母工程菌株成功组成型表达了kwPMEI,48h即达到最大表达水平,表达量约为66 mg/L。并且以甘油为碳源时kwPMEI表达量最高。成功分离纯化了kwPMEI,并经凝胶扩散方法检测表明其具有抑制活性。结论成功构建了组成型分泌表达kwPMEI的毕赤酵母菌株,为kwPMEI在果蔬汁中的进一步应用奠定了基础。     

THE DEVELOPMENT OF β-D-GLUCANASES DURING THE GERMINATION OF BARLEY AND THE EFFECT OF KILNING ON INDIVIDUAL ISOENZYMES†

Two endo-1,3;1,4-β-D-glucanase isoenzymes developed in response to gibberellic acid, during the germination of barley. Two endo-1, 3-β-D-glucanases, one present in ungerminated, steeped grain, also developed but did not appear to be markedly stimulated by the hormone. A comparison of crude and partially purified malt extracts highlighted the errors that are involved in the specific determination of endo-1, 3;1, 4-β-glucanase activity in crude extracts. The development and effect of kilning on individual malt isoenzymes was demonstrated by carboxymethylcellulose (CM-cellulose) chromatography profiles. Kilning and dry-milling of germinated barley caused losses of 80–90% in the specific endo-1,3;1,4-glucanase activity. The effect was less pronounced if wet-milling was substituted for dry-milling. Extraction studies and CM-cellulose chromatography profiles indicated that both endo-1,3;1, 4-β-glucanase isoenzymes were heat labile and were particularly susceptible to oxidation. In contrast, endo-1,3-β-glucanase activity and cellobiase activity in malt extracts were less affected by the kilning process or extraction procedures. Preliminary results suggested that one of the endo-1,3-β-glucanase isoenzymes was more sensitive to kilning.     

裂褶菌发酵产β-1,3-葡聚糖酶条件的优化

本文通过裂褶菌发酵培养获得β-1,3-葡聚糖酶,并对其发酵条件进行了研究.分别探讨了培养基中的碳源、氮源及无机盐对产酶的影响,并采用正交试验找到最佳的产酶培养基配方为葡萄糖2%,牛肉膏0.3%,NH4Cl0.1%,KH2PO40.05%,MgSO40.05%;对培养温度、起始pH值、接种量和培养时间等条件进行了优化,得...     

STUDIES ON CARBOHYDRATE METABOLIZING ENZYMES PART XXII. THE β-GLUCANASE SYSTEM OF MALTED BARLEY

Extracts of malted barley have been shown by molecular sieve chromatography to contain at least five enzymes which hydrolyse β-glucosidic linkages. In order of decreasing molecular weight, these are two β-glucosidases, an endo-β-1,4-glucanase, an endo-barley-β-glucanase and an endo-β-1,3-glucanase. This last-named enzyme was purified about 60-fold and shown to be specific for substrates containing only β-1,3-glucosidic linkages. This enzyme was activated by calcium ions, and deactivated by EDTA, but was not affected by chloride ions or a sulphydryl reagent. The endo-β-1,4-glucanase, which was purified about 50-fold, hydrolysed glucans containing only β-1,4- or a mixture of β-1,3- and β-1,4-linkages. The two β-glucosidases were shown to be true glycosidases and not exo-β-glucanases. The changes which occur in the levels of the various enzymic activities during the malting process have been measured.     

裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶培养基组成的优化研究

采用恒温摇床培养法培养裂褶菌,研究了裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶培养基组成中的碳源、氮源及各种无机盐的单因素参数,并采用四因素三水平正交实验对主要影响因素进行分析,从而确定最佳的产酶培养基配方为:葡萄糖2%,牛肉膏0.3%,NH4Cl0.1%,KH2PO40.05%,MgSO40.05%。     

裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶的特性研究

对裂褶茵所产内切β-1,3-葡聚糖酶进行有效分离纯化并用电泳法对其纯度进行鉴定,进而研究其酶学特性.结果表明:经过DEAE-Sephadex A-50离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤分离纯化得到电泳纯分子量约为45 kD的内切β-1,3-葡聚糖酶,其最适pH为5.0,最适温度为45℃;Fe<'2+>、B...     

Expression and purification of goat lactoferrin from Pichia pastoris expression system

ABSTRACT:  The recombinant goat lactoferrin (rGLF) was expressed in the methylotropic yeast Pichia pastoris using pGAPZαC vector, GAP as promoter, and Zeocin as the selective marker. After transformation of the GLF-pGAPZαC into Pichia pastoris X-33 expression host, the GLF-pGAPZαC vector was integrated into the GAP promoter locus of Pichia pastoris X-33 chromosome. The rGLF was expressed and secreted into the broth using α-factor preprosequence. SDS-PAGE and PAS staining analysis indicated that the rGLF could be purified to electrophoretic homogeneity by heparin-Sepharose 6 Fast Flow affinity chromatography and glycosylated by the expression host. The yield of purified rGLF was approximately 2.0 mg/L of culture broth. The N-terminal sequence was identical to the native goat lactoferrin (nGLF). The iron-binding behavior, papain-inhibiting property, and thermal stability of the purified rGLF were comparable to nGLF. This is the 1st report of intact goat lactoferrin expression using the P. pastoris system.     

裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化

采用不同饱和度的硫酸铵溶液对内切β-1,3-葡聚糖酶粗酶液进行分段盐析,以确定最佳盐析条件,将盐析处理后的酶液经透析浓缩、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析等进一步分离纯化,浓缩纯化后的含酶组分,经过SDS-PAGE电泳分析其纯度并初步确定其分子量。结果显示:经过纯化后的内切β-1,3-葡聚糖酶的比活力由20.90U/mg提高到933.37U/mg,纯化倍数为44.7倍,酶活回收率为11.6%,电泳分析呈单一条带,分子量近似为45ku。     

糖浓度对酒精酵母GJ2008果糖与葡萄糖利用差异性的影响

在不同糖浓度条件下,以YPDF培养基模拟甘蔗汁进行酒精发酵,测定过程中各参数的变化,并对果糖与葡萄糖消耗过程进行曲线拟合,以拟合方程计算出果糖与葡萄糖代谢一半和代谢完全所需时间.结果表明,糖浓度为90gL～270g/L,酵母GJ2008始终会偏用葡萄糖,果糖利用一直受到葡萄糖的竞争性抑制.糖浓度为90g/L时,细胞生长受糖浓度抑制程度最小,但乙醇产率较低;糖浓度为230g/L,发酵液中葡萄糖含量较低时,果糖受葡萄糖的竞争性抑制得到了解除,果糖的利用急剧加快;糖浓度为250g/L和270g/L,发酵液中葡萄糖含量较低时,果糖受葡萄糖的竞争性抑制得到了解除,但果糖的利用并没有加快,表现为后期酵母数维持值较低.糖浓度对果糖代谢的影响要大于对葡萄糖代谢的影响,较低糖浓度有利于后期果糖与葡萄糖利用差异性的缩小.     

β-1,3- 葡聚糖酶基因克隆、表达及抗菌活性的研究

通过RT-PCR的方法分别从小麦和水稻的cDNA中克隆获得β-1,3-葡聚糖酶基因(Glu基因),分别命名为TaGlu9507和OsGlu30。它们的序列分析表明这两个克隆均含一个1002bp的开放阅读框(ORF),编码334个氨基酸,各自的N-端含有一个长20和29个氨基酸残基的信号肽序列。将不含信号肽序列的TaGlu9507和OsGlu30编码区DNA片段分别克隆进pET28-a(+)表达载体,并转入大肠杆菌BL21(DE3),经0.5mmol/L IPTG诱导3h后获得了高量表达,表达量分别占大肠杆菌可溶性蛋白的49.7%和26.7%,表达产物对黑曲霉、酵母等真菌生长均有较为明显的抑制作用。本结果更进一步表明β-1,3-葡聚糖酶基因是植物真菌病防治的潜在目的基因群之一。