利用Real-time PCR技术分离鉴定酸乳中的乳双歧杆菌(Bifidobacterium Animalis Subsp.Lactis)

目的:利用Real-time PCR建立酸乳中乳双歧杆菌的快速精准鉴定方法。方法:选取乳双歧杆菌atpD基因,利用Primer Express 3.0.1设计引物探针,进而验证引物探针的特异性、灵敏度和抗干扰能力,最后应用到17种酸乳样品的检测。结果:所设计的引物探针可以有效地扩增出乳双歧杆菌,而对于20种乳酸菌和18种常见的致病菌都不能扩增,具有良好的特异性;其灵敏度在DNA水平可以达到1 pg/μL,在菌浓度水平可以达到10³ cfu/mL;并且不受酸乳中的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的干扰,具有很好的抗干扰能力。利用RT-PCR技术能很好地鉴定17种酸乳中乳双歧杆菌。结论:该研究建立了酸乳中快速精准鉴定乳双歧杆菌的方法,对食品中双歧杆菌鉴定起到积极推动作用。     

基于宏基因测序及分箱技术的复合乳酸菌发酵乳菌种鉴定及定量

复合乳酸菌发酵乳产品的菌种组成与定量是产品质量的关键。以3款市售复合乳酸菌发酵乳产品为研究对象,利用宏基因组测序和分箱分析、平均核苷酸一致性(average nucleotide identity, ANI)分析等技术,研究复合乳酸菌发酵乳产品中菌种种水平鉴定及相对定量。结果表明,产品A和产品C分箱获得的3个bin通过ANI分析鉴定为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)和动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis),与产品声称添加菌种一致,产品A中3个物种的相对丰度分别为96.85%、0.12%和3.02%,产品C中3个物种的相对丰度分别为99.55%、0.18%和0.14%。产品B分箱获得的3个bin通过ANI分析鉴定为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis),与产品声称添加菌种部分一致,3个物种的相对丰度分别为99.43%、0...     

乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌的实时荧光定量PCR检测方法

目的：为快速准确检测乳酸菌饮料中的嗜酸乳杆菌,建立实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法。方法：根据嗜酸乳杆菌NCFM的SPIDR保守区域设计特异性引物与探针,借助建立的实时荧光定量PCR方法进行特异性、灵敏度、重复性以及抗干扰能力验证,并利用模拟样品对方法进行检验,最后对市售的实际样品进行检测。结果：该方法的特异性较好;方法的绝对灵敏度达到3pg,相对灵敏度达103 CFU/mL;重复性检测表明相对标准偏差在2.6%以下。同时进行杂菌干扰实验,在纯基因组水平和培养物水平混合大肠杆菌,扩增均无明显影响,表明建立的方法抗干扰能力较好。利用建立的实时荧光定量PCR方法对模拟样品进行检测并建立标准曲线,得出R2为0.987,线性较好,可进行实际样品的检测。对市售的11 份样品进行检测,其中6 份含有嗜酸乳杆菌菌株,5份不含嗜酸乳杆菌菌株,标记嗜酸乳杆菌的样品全部检测出嗜酸乳杆菌且含量在5.83×102～3.68×104 CFU/mL之间。结论：建立的实时荧光定量PCR方法可快速、准确地检测出乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌。     

实时荧光定量PCR法鉴定发酵乳中嗜热链球菌

该研究通过系统发育树分析确定目标基因,根据目的基因设计特异性引物和探针,建立一种能够快速准确鉴定发酵乳中嗜热链球菌的实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-fqPCR）法,通过特异性、灵敏性和抗干扰实验对所建立方法进行验证,并使用该方法对市售的60份标识含有嗜热链球菌的发酵乳样品进行检测。结果表明,recA基因具有种间特异性,种间差异率＞10%,以其为目的基因建立的RT-fqPCR方法能够特异性的检测嗜热链球菌;绝对灵敏度达1 pg/μL,相对灵敏度达103 CFU/mL;在培养物水平和基因组水平抗干扰能力良好。采用该方法从60份标识含有嗜热链球菌的发酵乳样品中均能检测出嗜热链球菌,说明实时荧光定量PCR方法能够快速、准确的对发酵乳中嗜热链球菌进行检测。     

发酵奶中乳酸菌菌种检出及活菌计数调查

目的分析北京市场发酵奶(酸奶)在保质期内的乳酸菌数及乳酸菌菌种的检出率。方法对11个酸奶厂家的20种不同酸奶产品进行乳酸菌活菌计数及所用菌种的检验。结果在保质期间,双歧杆菌和嗜酸乳杆菌检出率分别为23.08%和27.27%;保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌分别为72.22%和94.44%。在保质期末,嗜热链球菌的平均活菌数为3.23×106CFU/ml,保加利亚乳杆菌为4.17×105CFU/ml,双歧杆菌为1.12×104CFU/ml,嗜酸乳杆菌为1.32×104CFU/ml。结论酸奶中嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的检出率及活菌数均高于双歧杆菌和嗜酸乳杆菌。     

荧光定量PCR法计数农家干酪中动物双歧杆菌乳酸亚种

分别利用荧光定量PCR及平板菌落计数法计数农家干酪中双歧杆菌的菌体数,通过对结果的比较分析,建立一种适用于快速、敏感、特异的检测干酪中双歧杆菌活菌数的方法。利用传统工艺制备双歧杆菌农家干酪,在其贮存期间分别采用荧光定量PCR及平板菌落计数法计数干酪中双歧杆菌的数量。其中,在利用荧光定量PCR法检测时,对影响PCR定量准确的因素进行系统研究,包括设计双歧杆菌引物,并对引物特异性进行评价、考察,从干酪基质中提取DNA的数量和质量,建立标准曲线。引物特异性验证结果表明,引物专一性强。采用试剂盒法从干酪样品中提取DNA的纯度较好,OD_(260)/OD_(280)均在1.75~1.82之间。除贮存第1天外,荧光定量PCR法计数结果比平板计数法高0.39%~2.25%,未见显著差异。荧光定量PCR具有灵敏、特异、简便和快速的特点,可用于干酪中双歧杆菌的定量检测。     

实时荧光PCR法鉴定食品中双歧杆菌

根据双歧杆菌属16S rRNA基因的保守区序设计特异性引物和探针,建立一种鉴定食品中双歧杆菌属的实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法。对方法的特异性、灵敏度、重复性和体系抗干扰能力进行验证,最后采用该方法对市售25 份标示含双歧杆菌样品进行检测。结果表明：该检测方法可特异性检测双歧杆菌属细菌,对近缘的乳杆菌属、链球菌属及食品中常见菌群包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等均无扩增。双歧杆菌DNA检测绝对灵敏度可达到2 pg,相对灵敏度可达到104 CFU/mL。重复性测试表明相对标准偏差小于1%。同时进行了杂菌干扰检测实验,在培养物水平和纯基因组DNA水平上将青春双歧杆菌ATCC15703与大肠杆菌ATCC25922混合进行检测,检出Ct值较纯菌检测时无显著影响,表明建立的荧光PCR方法抗干扰能力良好。对25 份市售实际样品进行测试,有5 份标识含有“双歧杆菌”的样品未检测出双歧杆菌成分。本研究所建立的实时荧光PCR法能准确、快速检测食品中双歧杆菌属细菌。     

益生菌发酵糙米饮料的制作工艺及其营养价值研究

为了开发新型发酵糙米饮料产品,选取干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、唾液乳杆菌、德式乳杆菌、酿酒酵母6株益生菌菌株进行了单菌和多菌复配发酵试验,通过发酵后产品的乳酸含量、p H值、氨基酸、水溶性肽等指标的检测与分析得到了最优发酵菌种组合为:干酪乳杆菌+嗜酸乳杆菌+双歧杆菌。以乳酸含量为主要指标,利用正交试验确定了发酵糙米饮料的最佳发酵工艺为料水比1.2∶10,接种量5%,发酵时间16 h。在此条件下,发酵饮料的乳酸含量为45 mmol/L,产品具有浓郁的发酵香味和米香味,滋味酸度适中,风味独特。通过与市售谷物饮料和市售乳酸菌饮料的营养指标对比发现,发酵糙米饮料综合了谷物饮料和乳酸菌饮料的优点,是一种高蛋白质,高膳食纤维,高活菌数,低脂肪,低能量的全面均衡营养型的饮料。     

鼠李糖乳杆菌HN001菌株水平快速定量方法的建立及应用

应用荧光定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR,qPCR),建立鼠李糖乳杆菌HN001菌株水平的快速定量检测方法。通过比对鼠李糖乳杆菌HN001的近缘菌株的基因组,筛选出鼠李糖乳杆菌HN001菌株水平的特异基因设计引物及探针,优化了反应体系和条件,建立鼠李糖乳杆菌HN001株水平的qPCR检测方法。对方法的特异性,灵敏度,检测限进行了验证,并以平板计数法进行对照验证进行了实际样品的检测。结果表明,所建立的方法特异性强与近缘菌株无交叉反应,鼠李糖乳杆菌HN001纯培养液检出限为102 CFU/mL,灵敏度可达到650copies/μL,可在3小时内完成样品检测。采用已建立的qPCR检测方法和平板技术法对市售添加鼠李糖乳杆菌HN001益生菌产品进行检测,该方法与平板计数方法检测结果一致性较好,在菌株水平上检测差异不显著(P＞0.05)。本研究建立的qPCR检测方法可有效应用于益生菌产品中鼠李糖乳杆菌HN001菌株水平定量检测,具有快速、灵敏、准确的特点。     

不同乳酸菌对凝固型荔枝酸奶的发酵特性和质构的影响

以纯牛奶和荔枝汁为主要原料,以干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌为发酵菌种,探讨三种乳酸菌的不同组合发酵对凝固型荔枝酸奶的发酵特性和质构的影响。结果表明:干酪乳杆菌产胞外多糖能力较强,单独发酵时胞外多糖含量达到22.50g/L,而嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌单独发酵时胞外多糖的含量分别为5.73 g/L和0.29 g/L;各种不同乳酸菌组合发酵后酸奶的表观粘度和持水力与胞外多糖的含量呈正相关(R2=0.98);干酪乳杆菌产酸能力弱,单独发酵后p H高于其它添加有嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的组合,导致酸奶的硬度偏低,但干酪乳杆菌联合嗜热链球菌或保加利亚乳杆菌发酵时,发酵酸奶的硬度和乳酸菌活菌数均明显优于单独发酵组。因此,当干酪乳杆菌与嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌联合发酵时,能充分发挥三个菌种的各自优势,菌落总数、胞外多糖含量和质构均能达到较好的品质水平。     

不同乳酸菌在冬瓜汁中的发酵特性研究

向鲜榨并经巴氏灭菌的冬瓜汁中接入不同的乳酸菌(干酪乳杆菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、双歧杆菌和保加利亚乳杆菌)进行发酵,比较发酵过程中乳酸菌活菌数、pH值、可滴定酸、总糖、还原糖、总多酚和色泽等变化和发酵后挥发性风味物质种类与相对含量。结果表明,冬瓜汁营养丰富,上述各种乳酸菌均能在冬瓜汁中很好地生长,其中干酪乳杆菌的生长速率(对数生长期)略低于其他6种菌;另外,七种乳酸菌发酵后冬瓜汁中主要挥发性风味物质主要有酸类、醇类、酯类、醛类、酮类五类,保加利亚乳杆菌发酵的冬瓜汁中检出的挥发性风味物质最多。除双歧杆菌之外其他六种乳酸菌发酵的冬瓜汁理化性质差别不大,双歧杆菌发酵的冬瓜汁在总色差上明显高于其他乳酸菌,且双歧杆菌的产酸能力最强,在发酵期间其可滴定酸含量最高。     

Interactions among lactic acid starter and probiotic bacteria used for fermented dairy products

Interactions among lactic acid starter and probiotic bacteria were investigated to establish adequate combinations of strains to manufacture probiotic dairy products. For this aim, a total of 48 strains of Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactococcus lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, and Bifidobacterium spp. (eight of each) were used. The detection of bacterial interactions was carried out using the well-diffusion agar assay, and the interactions found were further characterized by growth kinetics. A variety of interactions was demonstrated. Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus was found to be able to inhibit S. thermophilus strains. Among probiotic cultures, Lb. acidophilus was the sole species that was inhibited by the others (Lb. casei and Bifidobacterium). In general, probiotic bacteria proved to be more inhibitory towards lactic acid bacteria than vice versa since the latter did not exert any effect on the growth of the former, with some exceptions. The study of interactions by growth kinetics allowed the setting of four different kinds of behaviors between species of lactic acid starter and probiotic bacteria (stimulation, delay, complete inhibition of growth, and no effects among them). The possible interactions among the strains selected to manufacture a probiotic fermented dairy product should be taken into account when choosing the best combination/s to optimize their performance in the process and their survival in the products during cold storage.     

Selective enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus,Streptococcus thermophilus,Lactobacillus acidophilus,bifidobacteria, Lactobacillus casei,Lactobacillus rhamnosus,and propionibacteria

Nineteen bacteriological media were evaluated to assess their suitability to selectively enumerate Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, bifidobacteria, and propionibacteria. Bacteriological media evaluated included Streptococcus thermophilus agar, pH modified MRS agar, MRS-vancomycine agar, MRS-bile agar, MRS-NaCl agar, MRS-lithium chloride agar, MRS-NNLP (nalidixic acid, neomycin sulfate, lithium chloride and paramomycine sulfate) agar, reinforced clostridial agar, sugar-based (such as maltose, galactose, sorbitol, manitol, esculin) media, sodium lactate agar, arabinose agar, raffinose agar, xylose agar, and L. casei agar. Incubations were carried out under aerobic and anaerobic conditions at 27, 30, 37, 43, and 45 degrees C for 24, 72 h, and 7 to 9 d. S. thermophilus agar and aerobic incubation at 37 degrees C for 24 h were suitable for S. thermophilus. L. delbrueckii ssp. bulgaricus could be enumerated using MRS agar (pH 4.58 or pH 5.20) and under anaerobic incubation at 45 degrees C for 72 h. MRS-vancomycine agar and anaerobic incubation at 43 degrees C for 72 h were suitable to enumerate L. rhamnosus. MRS-vancomycine agar and anaerobic incubation at 37 degrees C for 72 h were selective for L. casei. To estimate the counts of L. casei by subtraction method, counts of L. rhamnosus on MRS-vancomycine agar at 43 degrees C for 72 h under anaerobic incubation could be subtracted from total counts of L. casei and L. rhamnosus enumerated on MRS-vancomycine agar at 37 degrees C for 72 h under anaerobic incubation. L. acidophilus could be enumerated using MRS-agar at 43 degrees C for 72 h or Basal agar-maltose agar at 43 degrees C for 72 h or BA-sorbitol agar at 37 degrees C for 72 h, under anaerobic incubation. Bifidobacteria could be enumerated on MRS-NNLP agar under anaerobic incubation at 37 degrees C for 72 h. Propionibacteria could be enumerated on sodium lactate agar under anaerobic incubation at 30 degrees C for 7 to 9 d. A subtraction method was most suitable for counting propionibacteria in the presence of other lactic acid bacteria from a product. For this method, counts of lactic bacteria at d 3 on sodium lactate agar under anaerobic incubation at 30 degrees C were subtracted from counts at d 7 of lactic bacteria and propionibacteria.     

Molecular quantification of lactic acid bacteria in fermented milk products using real-time quantitative PCR

Real-time quantitative PCR assays were developed for the absolute quantification of lactic acid bacteria (LAB) (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii, L. casei, L. paracasei, L. rhamnosus, L. acidophilus and L. johnsonii) in fermented milk products. The results of molecular quantification and classic bacterial enumeration did not differ significantly with respect to S. thermophilus and the species of the L. casei group which were detected in the six commercial fermented products tested, thus showing that DNA extraction was efficient and that genomic DNA solutions were free of PCR inhibitors. For L. delbrueckii, the results of bacterial enumeration were generally lower by a factor 10 to 100 than those of PCR quantification, suggesting a loss of viability during storage of the dairy products at 1-8 degrees C for most of the strains in this species. Real-time quantitative assays enabled identification of the species of lactic acid bacterial strains initially present in commercial fermented milk products and their accurate quantification with a detection threshold of 10(3) cells per ml of product.     

乳酸菌蛋白降解及产香能力分析

研究了分离自新疆酸奶疙瘩中6株乳酸菌在37℃下蛋白质降解和产香能力。结果表明,6株乳酸菌稳定期活菌数均在108CFU/mL以上,且凝乳细腻,具有良好的组织状态。各菌株发酵性能有差异,干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳脂乳球菌3株菌发酵性能较植物乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌发酵性能优,可用于不同风味和功能的发酵乳制品生产。其中,干酪乳杆菌具有良好的蛋白水解力,发酵15h,酪氨酸含量为594.33μg/mL;乳脂乳球菌产香性能好,发酵24h,丁二酮含量为12.32μg/mL、乙醛含量为59.27μg/mL,与其他菌株具有显著差异;瑞士乳杆菌具有强的产酸、产黏特性,发酵24h,酸度达159.76°T,黏度值1 389mPa·s。     

不同乳酸菌对椰子水饮料的发酵特性研究

以椰子水为原料,利用6株乳酸菌:发酵乳杆菌L20、面包乳杆菌32-2-2、短乳杆菌64-1、植物乳杆菌A33、嗜热链球菌IFFI6038和德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC6045发酵椰子水制备饮料,分析测定发酵椰子水主要成分、抑菌活性和感官评价的变化。试验结果表明,发酵48 h时,面包乳杆菌32-2-2发酵椰子水饮料总酸含量最高,达10.85 g/L;植物乳杆菌A33发酵椰子水饮料pH值最低为3.1;德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC6045发酵椰子水饮料还原糖含量最低为0.03 g/L;植物乳杆菌A33的抑菌谱最广;抑菌活性与pH值和乳酸含量呈显著相关性。植物乳杆菌、嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵椰子水感官评分较高。     

基于三代测序技术分析新疆鲜马奶和酸马奶中乳酸菌菌群结构

传统酸马奶受制作环境和工艺的影响,其菌群结构有所不同。本文运用Pacbio SMRT测序技术,基于乳酸菌特异性引物对新疆部分地区酸马奶和鲜马奶的乳酸菌菌群进行研究,结果表明:鲜马奶中乳酸菌丰富,以瑞士乳杆菌(35.52%)、唾液链球菌(10.11%)、乳酸乳球菌(9.49%)、嗜热链球菌(5.96%)以及德氏乳杆菌(5.37%)为主要乳酸菌菌种。酸马奶以瑞士乳杆菌(61.77%)、马乳酒样乳杆菌(14.91%)、乳酸乳球菌(9.76%)为主要乳酸菌菌种。鲜马奶中腐生葡萄球菌(4.45%)、金黄色葡萄球菌(2.62%)含量显著(P<0.05)高于酸马奶且具有致病性。此外,一些条件致病的链球菌属菌种在鲜马奶中被检出,具有潜在的安全风险,不建议直接饮用。酸马奶中含量较高的瑞士乳杆菌和桥乳杆菌显著正相关(r=0.582,P<0.01)。鲜马奶和酸马奶具有不同的乳酸菌菌群特征,自然发酵的酸马奶品质参差不齐。本文应用的乳酸菌特异性引物为低丰度乳酸菌菌种的挖掘提供参考,为酸马奶的工业化生产提供理论依据。     

原生物酸奶及其发展前景

介绍了原生物、乳酸菌、双歧因子的特点和种类，原生物酸奶的市场情况、菌种、生产、保健作用及发展趋势。原生物酸奶利用最多的是嗜酸乳杆菌和双歧杆菌，二者在抵抗上消化道酸性环境方面有协同作用。生产时需与传统菌种配合，发酵时间约６ｈ。酸奶中原生物可采用一种平板培养法单独计数。改良菌种和添加双歧因子，有望提高酸奶的保健效果。