DNA提取前处理方法对萨拉米香肠中细菌种群结构的影响

通过比较不同DNA提取前处理方法在高通量测序中对萨拉米香肠细菌种群结构的影响,为建立规范的高通量测序的操作流程优选出更适宜的前处理方法。采用直接提取法（M0）、拍击均质法（M1）和振荡珠磨法（M2）3 种常用前处理方法提取萨拉米香肠中细菌DNA,利用MiSeq高通量测序技术分析萨拉米香肠中细菌16S rRNA V3-V4区基因序列,以可操作分类单元（operational taxonomic unit,OTU）为基础分析细菌种群结构。结果表明,M0、M1和M2的OTU数分别为319、206和253;3 种方法共有的OTU数为129,占样品总OTU数的31.85%;Chao1指数分别为177.93±31.02、120.76±28.60、166.96±15.63;Shannon指数分别为2.79±0.22、2.95±0.31、3.25±0.30。在门和科分类水平,不同前处理方法获得的样品细菌种群结构相似,只有丰度上存在差异;但在属分类水平下,不同前处理方法可影响后续种群结构分析的结果。M0可增大优势菌的丰度及多样性,可用于检测样品在成熟过程中存在过的细菌。而M1和M2除去了游离DNA,只留下具有完整细胞结构的细菌菌体,更能反映出样品在取样时的细菌种群结构。当样品结构相对均一时,M1与M2的菌群结构和丰度趋于一致。本研究说明,不同的前处理方法可影响后续种群结构分析的结果。应该尽早建立统一的高通量测序操作与分析流程,确保数据的可靠性以及不同研究之间结果的可比性。     

基于高通量测序技术比较不同来源原料乳中的细菌特征

本文采用二代高通量测序技术研究北京、河北、内蒙古、天津四地区不同季节原料乳样品中的细菌多样性并对其进行功能预测。收集四地区不同季节原料乳样品23份,提取基因组DNA后使用Illumina Mi Seq测序平台对细菌16S rRNA的V3-V4"可变区"进行测序,结合数据库对原料乳中微生物群落分布、相对丰度和细菌功能基因代谢途径进行分析。原料乳中的细菌可分为33门732属,其中变形菌门(Proteobacteria),厚壁菌门(Firmicutes),拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)为主要菌门,平均相对丰度占微生物总数的99.37%。优势菌属为假单胞菌属(Pseudomonas)和不动杆菌属(Acinetobacter),平均相对丰度之和为60.55%。不同地区、不同季节原料乳微生物群落的结构组成和相对丰度存在差异,且假单胞菌属和气单胞菌属的相对丰度在不同季节原料乳中存在显著性差异(p0.05)。氨基酸代谢、碳水化合物代谢和膜运输为原料乳细菌主要的代谢途径。     

单核细胞增生李斯特菌进化家系的研究进展

单核细胞增生李斯特菌（以下简称单增李斯特菌）是危害严重的食源性致病菌之一,作为一种兼性厌氧的革兰氏阳性短杆菌,广泛存在于食品、环境及动物宿主体内。根据分子特征和流行情况的不同,可将其分成4 个进化家系,不同家系的菌株毒力和致病性各不相同。本文分析归纳了单增李斯特菌不同进化家系的特点,总结概述了其致病性和流行特征等,以期为研究与单增李斯特菌家系有关的食源性疾病提供一定参考。     

单分子实时测序技术研究不同来源原料乳中群落组成及多样性

目的 采用三代单分子实时测序法(single molecule real time sequencing, SMRT)研究北京和内蒙古两地原料乳中的细菌群落组成及多样性,解析其携带污染菌的差异,为原料乳质量及风险评估提供基础数据。方法 收集北京和内蒙古两地春夏季和秋冬季的原料乳样品20份,采用SMRT技术对其进行基于16S rDNA基因全长的测序和多样性分析。在此基础上,对其进行了微生物相关功能性预测。结果 不同产地与不同采样季节原料乳中细菌群落的结构组成和相对丰度存在差异,假单胞菌属、不动杆菌属与乳球菌属是大部分样品中相对丰度最高的细菌,其中脆弱假单胞菌的相对丰度与原料乳冷链运输时间正相关。功能预测揭示了原料乳脂肪质量可能具有地区差异性,维生素与氨基酸质量可能具有季节差异性。结论 两产地原料乳菌群分析结果提示了原料乳潜在的食品安全风险,并且除致病菌风险之外耐药菌及耐药基因传播的风险同样不容忽视;此外,乳球菌属细菌具有开发作为益生菌的潜力。本研究结果为原料乳的质量安全监测评估和功能菌种挖掘提供了参考依据。     

大长山岛虾夷扇贝养殖海区及其体内细菌数量周年变化

采用平板涂布法(PC法)对大连长海县大长山岛虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)养殖海区的表层海水、10m层海水、成年虾夷扇贝鳃中的异养菌和致病性弧菌数量的周年变化进行了调查研究。结果表明,表层海水、10m层海水和虾夷扇贝鳃中,异养菌和致病性弧菌数量最高值均出现于5~7月,异养菌数量最高值分别为7.9×105、5.9×105 cfu/mL和1.2×105 cfu/g,致病性弧菌数量最高值分别为1.6×102、1.7×102 cfu/mL和87cfu/g;最低值均出现于11月至次年1月,异养菌数量最低值分别为1.7×105、8.0×104 cfu/mL和2.7×104 cfu/g,致病性弧菌数量最低值分别为60、67cfu/mL和28cfu/g。虾夷扇贝的鳃中致病性弧菌数量于春季呈现最高值87cfu/g。     

鼠李糖乳杆菌HN001菌株水平快速定量方法的建立及应用

应用荧光定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR,qPCR),建立鼠李糖乳杆菌HN001菌株水平的快速定量检测方法。通过比对鼠李糖乳杆菌HN001的近缘菌株的基因组,筛选出鼠李糖乳杆菌HN001菌株水平的特异基因设计引物及探针,优化了反应体系和条件,建立鼠李糖乳杆菌HN001株水平的qPCR检测方法。对方法的特异性,灵敏度,检测限进行了验证,并以平板计数法进行对照验证进行了实际样品的检测。结果表明,所建立的方法特异性强与近缘菌株无交叉反应,鼠李糖乳杆菌HN001纯培养液检出限为102 CFU/mL,灵敏度可达到650copies/μL,可在3小时内完成样品检测。采用已建立的qPCR检测方法和平板技术法对市售添加鼠李糖乳杆菌HN001益生菌产品进行检测,该方法与平板计数方法检测结果一致性较好,在菌株水平上检测差异不显著(P＞0.05)。本研究建立的qPCR检测方法可有效应用于益生菌产品中鼠李糖乳杆菌HN001菌株水平定量检测,具有快速、灵敏、准确的特点。     

肉类调理食品中细菌多样性的分析

肉类调理食品方便快捷,营养美味,深受消费者青睐,但其丰富的营养物质容易造成微生物的滋生,影响食品品质和消费者健康。高通量测序技术可以全面、准确的研究肉类调理食品中微生物群落结构,为微生物防控和标准化生产提供理论基础。本文通过均质提取法对肉类调理食品中微生物基因组进行提取,并以16S rRNA可变区V3-V4作为测序片段,分析细菌多样性。实验表明,4种肉类调理食品细菌多样性均较高,菌群结构具有一定的相似性,炸鸡块、骨肉相连和冷冻牛排的优势菌群是Anderseniella属,而羊肉串优势菌群是不动杆菌属,此外肉类调理食品中还存在芽胞杆菌属、梭菌属、泛菌属、假单胞菌属、嗜冷杆菌属和乳球菌属等。本论文明确了使用均质提取法对肉类调理食品中微生物进行16S rRNA V3-V4区测序分析,为后续大规模菌群研究提供思路和方法。     

肉制品中致泻大肠埃希菌的分子特征分析

目的 了解国内肉制品中致泻大肠埃希菌（DEC）的流行特征。方法 运用全基因组测序技术对86株DEC进行分子特征分析，明确优势病理类型、序列型和血清型。通过全基因组单核苷酸多态性分析，确定我国肉制品来源DEC菌株之间的系统发育关系。结果 肉制品中致泻大肠埃希菌的病理类型以EAEC为主，86株DEC可分为8种毒力基因型，包括48个ST型（包括6个新ST型）和55个O:H血清型；ST11和CC10为优势序列型和克隆复合体，O157、O15和O6为优势血清群。DEC菌株间表现为高度的遗传异质性，相同病理类型的同源性较低，处在不同的进化分支上。结论 DEC的病理类型与ST型及血清型间未见对应关系，通过对ST型及血清型的监测不能直接对病理类型进行判断，但数量最多的ST型及血清型揭示了DEC的主要危害特征与防控点。可根据全基因组测序结果补充和优化DEC的判定方法，为今后DEC的溯源及流行病学调查提供数据支撑。