环介导等温扩增技术检测花生过敏原

花生引起的过敏已经越来越受到重视,因此对花生过敏原进行检测也变得越来越重要。目前对花生过敏原的检测大多数采用抗原抗体法或PCR方法,抗原抗体法耗时比较长,而PCR方法需要昂贵的仪器设备。本项目通过建立环介导等温扩增快速检测技术来检测食物中花生过敏原的基因,为食品中花生过敏原成分检测提供方便。该方法快速,简便,灵敏度高,可以很好的应用到现实检测中去,这个方法的建立具有很重大的意义,为食品的安全检测提供了很大的方便。     

两种PCR方法检测食品中花生过敏原Arah1成分

采用套式PCR和荧光实时定量PCR两种方法检测食品中花生主要过敏原Ara h1基因成分,从而推断食品中是否含有花生过敏原成分。根据GenBank提供的花生主要过敏原基因Ara h1 DNA序列(登录号为AF432231)的中一段序列分别设计2对内外特异性引物,扩增目的基因片段来建立套式PCR方法;再用上述内引物扩增目的片段,建立SYBRGreenⅠ荧光实时定量PCR方法,绘出拷贝数-CT标准曲线;并通过这2种PCR方法检测8种食品中含有花生主要过敏原Ara h1基因成分。套式PCR方法具有较高的特异性和灵敏度,SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR方法的标准曲线在3×102至3×108 copies范围内线性关系良好,R2值为0.993 5,检测低限设定为3×103 copies。2种方法检测8种食品样品,结果均与食物过敏原标注内容相符。本研究建立的2种方法具有快速、灵敏等优点,可用于食品中花生主要过敏原基因Ara h1成分的检测。     

利用邻位连接技术检测花生过敏原成分

建立一种新型花生过敏原成分的快速筛选检测方法--邻位连接技术检测方法。针对花生过敏原选择适当的鼠源单克隆抗体,并合成针对花生过敏原的兔源多克隆抗体然后与磁颗粒偶联,而后将羊抗兔二抗与一条DNA分子耦联制成亲和探针1,将另一条寡核苷酸序列与羊抗鼠二抗耦联制成亲和探针2,上述成分能够与一连结DNA组合成邻位连接复合物,建立邻位连接检测花生过敏原的方法。使用3种花生过敏原标准品和10种确定不含花生过敏原的样本进行特异性试验;通过稀释花生过敏原标准品进行灵敏度验证。建立方法具有很好的特异性;检测标准品的灵敏度为0.01 ng/m L,比普通ELISA试剂盒灵敏度提高了1 000倍。建立的邻位连接检测花生过敏原的方法能够检测出使用目前常规方法不能检测到的花生过敏原,具有重要的实际意义。     

胶体金免疫层析法检测食品中花生过敏原蛋白成分

建立一种简易快速胶体金免疫层析法(GICA)用于检测食品中花生蛋白成分.采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒、标记抗花生蛋白成分的抗体,制成免疫层析测试条.食品中花生蛋白成分与测试条上金标记抗体结合后沿着硝酸纤维素膜移动,与膜上的固相抗体结合形成肉眼可见的红色线条.自制花生抗原标准品并检测该方法的灵敏度,同时检测19种食品中是否含有花生蛋白成分.结果表明:GICA测试条与花生蛋白抗原呈特异性反应.检测自制的花生抗原标准品的灵敏度可达50ng/mL,用GICA试条检测了19种食品中,其中13种食品标签上标注含有花生过敏原成分的食品检测结果均呈阳性,4种食品标签上标注不含花生过敏原成分的食品检测结果均呈阴性,而2种食品标签上没有标注过敏原成分的食品检测呈阳性.     

时间分辨免疫荧光法测定食物中花生过敏原成分

目的:建立双抗体夹心时间分辨荧光免疫法[Time-resolved Fluoroimmunoassay(TRFIA)]测定食物中花生过敏原蛋白成分,为进出口食品中花生过敏原成分检测和由花生导致的食物过敏性疾病的预防提供技术基础。方法:提取花生蛋白,免疫小鼠制备抗花生总蛋白的多克隆抗体,用该抗体包被酶标板,并用生物素标记该多抗作为捕捉抗体,Eu3+标记的链酶亲和素和以β-二酮体为主的增强液等试剂,建立双抗夹心TRFIA方法,检测该方法的灵敏度,同时用于13种食品中花生过敏原蛋白成分检测。结果:初步地研制出双抗体夹心TRFIA法检测食品中花生过敏原蛋白成分,具有特异性,和其最低检出限为0.1ng/mL,标准曲线在0.1～160ng/mL范围内线性良好;11种食品检测结果与食物过敏原标签标注内容相符,而2种标示不详的食品检测结果均呈现阳性。     

双抗体夹心ELISA法测定食物中花生过敏原蛋白成分

通过建立双抗体夹心ELISA法测定食物中花生过敏原蛋白成分,为进出口食品花生过敏原成分检测和由花生导致的食物过敏性疾病的预防提供技术基础.提取花生总蛋白,免疫小鼠制备抗花生总蛋白的多克隆抗体,用该抗体包被酶标板,并用生物素标记该多抗,从而建立双多抗体夹心ELISA法;自制花生总蛋白标准品并检测该方法的灵敏度,同时检测15种食品中是否含有花生蛋白成分.成功地研制出双抗体夹心ELISA法检测食品中花生过敏原蛋白成分,具有特异性,其最低检出限为8ng/mL,标准曲线在8 ng/mL～125 ng/mL范围内线性良好;13种食品检测结果与食物过敏原标签标注内容相符,而2种标示不详的食品检测结果均呈现阳性.     

质谱方法在过敏原研究中的应用

食品过敏已经成为全球范围内重要的食品安全问题,迫切需要高灵敏度、高特异性的方法对食品中的过敏原进行快速、可靠的检测。检测食品中过敏原最常用的是核酸的方法和酶联免疫的方法,质谱技术的发展,为过敏原的研究提供了新的手段。质谱分析具有灵敏度高、样品用量少、分析速度快等优点,因此,质谱方法逐渐应用于食品过敏原的检测。本文从榛子、花生和牛奶角度,总结质谱技术在过敏原检测中的一些应用。     

花生过敏原及其检测方法研究进展

花生过敏可导致某些人群严重的食品安全问题。过敏患者只能通过避免食用含有花生过敏原成分的食物来避免过敏。但是,食品在生产加工、储存、运输、销售过程中有可能被过敏原污染。因此,确定各类加工食品中是否含有花生过敏原成分,对于预防食用者发生花生过敏反应具有重要意义。花生中已确定的过敏原蛋白有13种(Ara h 1~Ara h 13)。本文综述了花生中过敏原蛋白的结构信息,当前流行的提取方法,以及各种定性定量的检测方法,总结了各种方法的优缺点。同时对建立一种具有特异性强、灵敏度高、定量准确的花生致敏蛋白检测方法的发展趋势进行了展望。     

实时定量PCR技术检测食品中花生过敏原Ara h1基因成分

采用Taqman探针PCR技术,建立食品中花生主要过敏原基因Ara h1的检测方法.根据GenBank提供的Ara h1基因(序列号AF432231)中一段DNA序列设计特异性引物与Taqman探针,扩增该目的基因,建立拷贝数-CT标准曲线,可通过标准曲线方程计算食品中含有花生主要过敏原Ara h1基因拷贝数(copies),并用于检测8种食品中是否含有残留的该过敏原基因.此标准曲线在1.5×103copies～1.5×107copies范围内线性关系良好,R2值为0.9759;8种样品检测结果与食物过敏原标注内容相一致.     

小麦和榛子过敏原成分检测的实时荧光PCR方法

过敏原风险问题已成为重要的食品安全问题,如何快速准确地检测出食物中的过敏原成为当前亟需解决的关键。目前常用的过敏原检测方法有免疫学检测、质谱及SPR等技术,但这些方法均有一定程度的局限性。通过引入分子生物学鉴定手段,建立小麦、榛子的过敏原基因数据库,并依据数据库寻找特异性序列并设计探针引物,建立一种快速、便捷、高效的过敏原检测方法,并适当调整了方法的检出限,降低了检测误判的风险。通过建立实时荧光PCR方法,可快速筛选样品的过敏原基因,简化了食品中过敏原成分的鉴定,降低了实验成本与技能要求,降低了检测的难度,缩短了实验时间。通过适用性验证与检出限验证实验,该方法用于过敏原成分鉴定可以达到理想的效果,重复性好,准确率高,检出限为1%。     

花生致敏原检测技术的研究进展

目前食物致敏原检测已经成为食品安全领域面临的重要话题。花生是一种主要的食物致敏原, 开展食 品中花生致敏原检测技术研究, 对预防过敏反应, 快速诊断病情, 保障食品安全具有重要意义。本文综述了近 十年来花生致敏原检测技术的研究进展, 介绍了花生的致敏机制, 分析了不同检测方法的优缺点, 举例说明了 这些方法的实际应用, 讨论了该领域面临的挑战, 旨在为花生的致敏原检测、脱敏技术等研究提供有价值的参 考意见。     

DNA 提取方法对实时荧光定量 PCR 检测花生过敏原 Ara h 2 基因的比较研究

目前,食物过敏是一个世界性的公共卫生问题,其中花生过敏最为严重。基于DNA的分子生物学检测方法目前已广泛应用于花生过敏原检测,样品DNA的提取质量会显著影响检测的灵敏度及准确率。本研究比较了5种DNA提取方法,包括十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB）法、柱式法及3种基于磁珠纯化技术的DNA快速提取法,对生花生、煮花生、炸花生、烤花生、花生酥和花生酱6种不同加工方式的花生基质样品进行DNA提取,考察了不同方法获得的DNA浓度、纯度指标,并采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）对花生过敏原Ara h 2基因进行了检测分析。结果表明,月桂酰肌氨酸钠（Sodium Lauroyl Sarcosine）磁珠法（简称SLS磁珠法）的适用性广、提取率高,对于6种花生基质提取的DNA均能高效检出花生过敏原Ara h 2基因;对于花生含量为0.05%～1.00%的小麦粉二元混合物,SLS磁珠法的DNA提取率总体优于CTAB法,并且能有效提取出与花生共用一条生产线的燕麦片中污染的花生DNA,证实SLS磁珠法提取的实际样品DNA能够满足花生过敏原检测目的。本研究为花生及其制品DNA提取方法提供了参考,特别是磁珠类方法,高效快速,提取质量能够保障后续基于DNA的花生过敏原分子生物学方法检测结果的准确性。     

Development of three real-time PCR assays to detect peanut allergen residue in processed food products

Hypersensitivity to peanut is a public health problem, since the ingestion of even low amounts of peanut can trigger severe allergic reactions. Allergic consumers rely on the information provided on the label of foodstuffs to identify products that might endanger their health. In order to protect the allergic consumer methods are required for the detection of allergenic ingredients. For this purpose we have developed three real-time polymerase chain reaction (PCR) assays, based on TaqMan chemistry, that are capable of detecting peanut specific DNA sequences in food products. The peanut specific sequence targeted for detection is located within the gene family of the allergen Ara h 3. The occurrence of multiple Ara h 3 sequences in the peanut genome increases the chance to achieve a good sensitivity. DNA extraction is also known to affect detection by PCR, therefore the efficiency of several different DNA extraction methods was compared. The methods reported here are capable of detecting 2.5 pg peanut DNA (less than one copy of peanut genome equivalent) and all three assays were successfully applied to detect peanut traces in a model food product where they could detect 10 mg kg⁻¹ peanut.     

超高效液相色谱-电喷雾质谱法检测花生 过敏原Ara h 2

目的建立烘培食品中花生过敏原Ara h 2的液相质谱联用定量检测方法。方法选择花生蛋白中的致敏蛋白Ara h 2作为目标蛋白,筛选出该致敏蛋白的特异肽,人工合成特异肽标准品和特异肽内标,从而建立直接检测花生致敏蛋白Ara h 2的准确定量方法。同时还对全国不同地区的20种花生中致敏蛋白Ara h 2的含量进行检测分析,初步统计得出致敏蛋白Ara h 2和花生蛋白的换算系数,并以Ara h 2作为生物标记物检测10种烘培食品中花生蛋白的残留量。结果花生样品中致敏蛋白Ara h 2的定量限为4.45μg/g,回收率在106.0%~107.8%之间。烘培食品中,定量限可达到6.23μg/g,回收率在107.0%~113.2%之间。结论本方法特异性强、灵敏度高、定量准确,具有良好的应用前景。     

花生过敏及其主要致敏原Ara h1的研究进展

花生是一种具有致敏作用的重要食品,能够引起严重的过敏反应。花生的致敏性研究是食物安全研究领域的一个重要课题。本文主要论述了近年来花生致敏现状及花生主要致敏原Ara h1研究进展,包括花生致敏特点、脱敏方法等方面的内容。对降低花生引起的过敏反应风险具有一定意义,同时为对花生过敏者的临床脱敏治疗提供理论依据。     

A two-site monoclonal antibody immunochromatography assay for rapid detection of peanut allergen Ara h1 in Chinese imported and exported foods

Food allergen labeling has not yet been implemented in China. Therefore, a gold immunochromatography assay (GICA) was developed using two monoclonal antibodies (mAb) against the peanut allergen Ara h1. The GICA was specific for standard peanut samples with a sensitivity of 10 ng/ml. Peanut protein traces extracted from 124 food products imported and exported by China Customs were easily and rapidly detected by GICA. 68 food samples originally labeled as containing peanuts were positive for Ara h1 and 54 food samples labeled as not containing peanuts were negative for Ara h1, indicating that the labels from the manufacturers were accurate. However, 2 food samples labeled as not containing peanuts tested positive for Ara h1. The present GICA provides a fast, simple, semi-quantitative method for the determination of peanut allergens in foods. This detection system can be used to ensure the safety of food imported and exported by China Customs.     

基于Arah6的花生间接竞争ELISA检测方法的建立

建立了基于花生主要过敏原蛋白Arah6的间接竞争酶联免疫检测法,实现了对食物中花生的定量检测。利用花生过敏原Arah6纯品免疫新西兰大白兔,制得兔抗Arah6的多克隆抗体,以Arah6纯品作为包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗,确定了包被抗原质量浓度为1μg/mL,一抗最佳稀释度为1:50000,酶标二抗稀释度为1:5000。此检测方法对Arah6的定量检测范围为16.5～10000ng/mL(折合成含花生的含量,约为165ng/mL～100μg/mL),抑制方程为抑制率I=21.418lgC-6.0633(C为Arah6的质量浓度,单位ng/mL),IC50为414.6ng/mL,相关系数R2=0.9989。该检测方法灵敏度高,检测范围广,适用于食品中花生现场快速检测。     

High-pressure microfluidisation-induced changes in the antigenicity and conformation of allergen Ara h 2 purified from Chinese peanut

BACKGROUND: Peanut allergy is one of the most serious food allergies, and Ara h 2 is one of the most important peanut allergens as it is recognised by serum immunoglobulin E from more than 90% of peanut‐allergic individuals. Dynamic high‐pressure microfluidisation has been widely used in food processing as a new technology. The aim of this study was to investigate the effect of high‐pressure microfluidisation on the antigenicity and structure of Ara h 2. Extracted peanut allergen Ara h 2 was treated under a continuous pressure array of 60, 90, 120, 150 and 180 MPa. Immunoreactivity was measured by indirect enzyme‐linked immunosorbent assay with rabbit polyclonal antibodies. Secondary structure was analysed by circular dichroism. Surface hydrophobicity and sulfhydryl groups were assessed via fluorescence and UV absorption spectra respectively. RESULTS: High‐pressure microfluidisation treatment decreased the antigenicity of peanut allergen Ara h 2, changed its secondary structure and increased its UV absorption intensity and surface hydrophobicity. CONCLUSION: The change in conformation contributed to the decrease in antigenicity of Ara h 2, and the spatial conformation of peanut allergen Ara h 2 plays a critical role in its antigenicity. Copyright © 2011 Society of Chemical Industry     

加工方式对花生致敏性的影响及其致敏性评价研究进展

花生蛋白是一种理想的食品加工原料,同时也是一种致死率较高的食物过敏原,严重危害人类健康。本文主要综述食品加工方式对花生过敏蛋白致敏性的影响,以及体内、体外致敏性评价方法,为低致敏或无致敏花生制品的开发提供参考和指导。