凡纳滨对虾内源蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解作用

为确定引起凡纳滨对虾自溶的主要酶类及分布部位,本文测定了凡纳滨对虾各内源蛋白酶的活性,分析主要内源蛋白酶贮藏期间的变化,并比较主要内源蛋白酶对虾肌原纤维蛋白的降解作用。结果显示,虾头蛋白酶活达90.17U/mg,是虾肉的300倍。虾头中的胰蛋白酶活性最高,达13.59U/mg。全虾贮藏4d后虾肉总酶活和胰蛋白酶活增加,于第8d虾肉第一腹节总酶活增至1.66U/mg,胰蛋白酰胺酶和酯酶活分别达到0.97U/mg和1.84U/mg。SDSPAGE结果显示,随贮藏温度和时间的增大,内源酶对肌原纤维蛋白的肌球蛋白重链(MHC)和肌动蛋白(Actin)降解程度越大,其中虾头中胰蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解作用最强。因此凡纳滨对虾胰蛋白酶很可能是肌肉软化的主要作用酶。     

牦牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶提取工艺的优化

为研究牦牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶的最佳提取条件,本实验以牦牛背最长肌为研究对象,以高铁肌红蛋白还原酶活力为考察指标,在单因素试验的基础上,采用响应曲面分析法,以高铁肌红蛋白还原酶活力为响应值,对磷酸盐缓冲液、Tris-HCl和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液3 种提取液的pH值、浓度和料液比3 个因素进行优化。结果表明：各因素对酶活力的影响大小顺序依次为提取液的pH值＞料液比＞浓度;最佳提取参数为磷酸盐缓冲液pH 7.22、料液比1∶2.25（m/V）、浓度2.12 mmol/L,在此条件下酶活力为73.92 U/L,与理论预测值的相对误差为0.86%,说明本实验所建立的模型在实践中具有可行性。     

柠檬酸沉淀法提取生姜蛋白酶的工艺优化

目的对柠檬酸沉淀法提取生姜蛋白酶的工艺进行优化,并确立最佳酶反应条件。方法采用柠檬酸沉淀法提取姜汁中生姜蛋白酶,比较加入不同浓度柠檬酸反应后的酶活力值;在不同pH缓冲液、底物浓度和温度条件下测定酶比活力,并确定最佳酶反应条件。结果柠檬酸浓度为20 mmol/L时,酶活力最高,为353.153 U。最佳酶反应条件如下:反应底物浓度为1%,反应温度60℃,反应pH值为5。结论柠檬酸沉淀法操作简单、提取效率高,通过生姜蛋白酶酶促反应的条件优化,可以实现生姜蛋白酶酶活的快速测定。     

牦牛肉组织蛋白酶L提取工艺的优化

为了获得提取牦牛肉中组织蛋白酶L的最佳工艺参数,首先采用Plackett-Burman试验对影响酶活力的7个因素进行筛选,发现浸提缓冲液pH值、L-Cys浓度及(NH4)2SO4饱和度3个因素显著影响酶活力。基于该3个因素的最陡爬坡试验、中心组合设计及响应面分析结果表明:3个因素对酶活力的影响大小依次为浸提缓冲液pH值>(NH4)2SO4饱和度>L-Cys;最佳提取工艺为:浸提缓冲液pH值5.68、L-Cys浓度为6.48 mmol/L、(NH4)2SO4饱和度为76.63%。在此条件下,酶活力最高为13.98 U/mg。试验结果与模型预测值吻合良好,说明所建模型切实可行,为进一步研究牦牛肉组织蛋白酶L的提取工艺提供理论依据。     

影响猪胰蛋白酶提取部分工艺因素研究

目的:研究猪胰蛋白酶的提取工艺,提高猪胰脏的利用价值,变废为宝,减少对环境的污染。方法:实验采用Tris-HCl缓冲液为提取剂,硫酸铵盐析和对猪胰蛋白酶的提取及纯化工艺进行了研究。通过单因素实验和正交实验,对影响猪胰蛋白酶收率和活力的诸因素进行了研究,最后确定了最佳工艺条件。结果:所得的最佳工艺条件:料液比1∶5、Tris-HCl浓度0.05mol/L、激活pH8、激活时间6h。结论:所制得的胰蛋白酶比活力为6600BAEE/mg,胰蛋白酶收率为6.5%,该工艺简单,提取效率高,产品酶活高。     

凡纳滨对虾组织蛋白酶L性质分析及其对肌肉蛋白的降解

本研究从凡纳滨对虾肝胰腺中纯化获得一种组织蛋白酶L,其分子质量约为31 k D,肽质量指纹图谱分析得到8个片段共112个氨基酸残基,与报道的凡纳滨对虾组织蛋白酶L序列完全一致。该酶的最适温度和最适pH值分别为35℃和5.5,且在0~40℃以及pH 5.5~6.5之间酶活力稳定。该酶仅对底物Z-Phe-Arg-MCA特异分解。半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64和Leupeptin对其有明显的抑制作用,而金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸和乙二醇二乙醚二胺四乙酸对其有少量的激活作用。扫描电子显微镜观察结果显示,随着低温贮藏时间的延长,对虾肌肉纤维的断裂程度不断增加。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示,组织蛋白酶L可使肌肉蛋白发生分解,推测其可能参与对虾低温贮藏过程中肌肉的降解。     

干酪乳杆菌胞壁蛋白酶提取条件优化及其水解特性研究

干酪乳杆菌细胞壁蛋白酶是其蛋白水解系统中一个关键的蛋白酶.采用Ca2+-free法研究干酪乳杆菌细胞壁蛋白酶的提取方法,确定其最佳实验条件.菌体用含有30 mmol/L CaCl2的50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0)缓冲液洗涤3次,然后用含有50.03 mmol/LEDTA-Na2的50 mmol/LTris-HCl(pH6.98)缓冲液悬浮,39.75℃保温,60 min后取出离心(4 500 r/min、20 min、4℃),上清液即粗酶液.用粗酶液与纯化后的酶分别水解各种酪蛋白,粗酶较纯化后的酶能产生更高的ACE抑制能力,而纯化后的酶水解β-酪蛋白产生的抗ACE活性能力最强.     

白鲢鱼肌肉脂肪氧合酶提取条件优化及酶学性质研究

本文以白鲢鱼肌肉为原料,通过单因素实验对白鲢鱼肌肉脂肪氧合酶(LOX)提取条件进行优化;用圆二色谱法和荧光光谱法对其贮藏稳定性、热稳定性、最适p H进行研究;探讨磷酸盐缓冲液p H、离子强度、二硫苏糖醇(DTT)和乙二胺四乙酸(EDTA)添加量对白鲢鱼肌肉LOX提取工艺的影响。结果表明,白鲢鱼肌肉LOX适宜提取条件为磷酸盐缓冲液p H7.8、离子强度50 mmol/L、EDTA和DTT添加量均为2 mmol/L,在此条件下提取白鲢鱼肌肉LOX的酶液浓度为(1.98±0.037)mg/m L,活力为(244.44±5.93)U。通过对LOX酶学性质研究可知,白鲢鱼肌肉LOX在常温条件下0~2 d内酶活性较为稳定,最适作用温度为40℃,最适p H为7.8。     

蓝圆鲹肌肉组织蛋白酶B的纯化与性质分析

在鱼糜制品生产过程中,凝胶劣化现象是引起鱼糜品质下降的重要原因。研究表明,溶酶体中的内源性组织蛋白酶B会促进肌原纤维蛋白的降解,进而导致鱼糜凝胶劣化。迄今为止,多种鱼体肌肉中的组织蛋白酶B已有研究,但海水经济低值鱼蓝圆鲹中该酶的情况却尚未报道。本研究采用硫酸铵沉淀和柱层析相结合的方法,从蓝圆鲹肌肉中分离纯化得到分子量约为27ku的组织蛋白酶B。酶学性质结果显示,该酶最适温度和最适pH分别为55℃和5.5,半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64能有效抑制其活性。对肌原纤维蛋白的降解实验表明,在最适条件下,蓝圆鲹组织蛋白酶B对肌原纤维蛋白有一定的降解作用。因此,组织蛋白酶B参与肌原纤维蛋白的降解,更可能参与在低pH条件下鱼糜凝胶劣化。     

响应面法优化鸡胸肉肌原纤维蛋白酶法水解工艺条件

以鸡胸肉为原料,提取肌原纤维蛋白,测定其蛋白质浓度及氨基酸组成;以水解度为测定指标,利用响应面法优化该肌原纤维蛋白酶解工艺条件,并考察其产物肽分子量分布。结果表明:提取的肌原纤维蛋白浓度为59.27%;该蛋白氨基酸种类齐全,组成比例均衡,必需氨基酸含量高达40.90%;碱性蛋白酶是肌原纤维蛋白酶解的最佳用酶;在单因素实验基础上,经Box-Behnken实验优化得到碱性蛋白酶水解肌原纤维蛋白最佳工艺条件为:加酶量3500 U/g、p H7.8、温度44℃,此条件下经6 h酶解,水解度达33.17%;肽分子量分布分析知,最佳水解条件下酶解液中1000 u的小肽含量高达61.5%,说明碱性蛋白酶能较高程度的水解肌原纤维蛋白。     

基于内源酶活性变化的冷藏哈氏仿对虾肌肉品质研究

目的:探究冷藏条件下哈氏仿对虾内源酶活性及肌肉品质特性的变化情况。方法:以哈氏仿对虾为对象,在0 ℃冷藏0、2、4、6 d,比较分析完整虾组和去头虾组肌肉的质构、TCA-可溶性肽、肌原纤维蛋白含量及其小片化指数以及虾头与肌肉中各种内源酶活性的变化规律。结果:随着冷藏时间的延长,两组虾肌肉中TCA-可溶性肽含量及肌原纤维小片化指数均呈现上升趋势;肌原纤维蛋白含量呈下降趋势,完整虾组和去头虾组肌肉在冷藏6 d后分别降低了56.65%和44.63%;而两组虾肉的硬度和弹性也始终呈现出下降趋势。在冷藏过程中,完整虾组虾头中胰蛋白酶活性逐渐下降,而其肌肉中活性则不断增加,去头虾组肌肉中该酶活缓慢下降,完整虾组虾头及肌肉、去头虾组肌肉中分别变化了16.9%、68.8%和15.2%;钙蛋白酶活性在两组肌肉中均随冷藏时间延长而不断下降,其中以完整虾组肌肉下降幅度较明显;在冷藏过程中组织蛋白酶B、D、H及L活性变化情况有所不同,其中去头虾组肌肉中4种组织蛋白酶活性整体高于完整虾组;两组虾肌肉中4种组织蛋白酶的活性在各亚细胞组份中,随着冷藏时间延长而逐渐下降,且完整虾组中活性高于去头虾组。结论:在冷藏过程中,去头虾组肌肉的品质特性优于完整虾组,且完整虾组中各种内源酶活性相对高于去头虾组,因此以去虾头方式进行贮藏更利于对虾肉品质的保障。     

青霉菌对刚毛藻纤维素降解的研究

研究了青霉菌对刚毛藻中纤维素的降解条件。首先通过单因素试验,研究了氮源种类、硫酸铵含量、料液比、pH、发酵温度、发酵时间对纤维素降解的影响。选择了pH值、料液比、硫酸铵含量进行L9（33）正交试验设计,考察各因素对蛋白、总糖含量、纤维素酶活的影响,得出最佳降解条件：藻粉3 g/L,料液比1∶15（g∶mL）,硫酸铵20 g/L,磷酸二氢钾1 g/L,硫酸镁0.5 g/L,缓冲液pH 6.0,发酵温度为30 ℃,发酵时间为7 d,在此条件下,蛋白含量为12.44 g/100 g,总糖含量0.58 mg/g,纤维素酶酶活4.84 U/g。     

暗纹东方鲀肌肉组织蛋白酶B提取工艺优化

为获得暗纹东方鲀组织蛋白酶B的最佳提取工艺条件,在单因素试验的基础上,通过Plackett-Burman设计对影响组织蛋白酶B活力的因素进行筛选,结果表明：料液比、磷酸盐缓冲液pH值和硫酸铵饱和度这3 个因素显著影响酶活力,然后用响应面分析法确定了主要影响因素的最佳提取条件为：料液比1∶2.1、磷酸盐缓冲液pH 7.0、硫酸铵饱和度99.2%,在此条件下组织蛋白酶B活力的预测值为32.65 U/g,实测值为32.52 U/g,相对误差为0.39%。说明建立的模型切实可行,为进一步研究组织蛋白酶B的提取工艺提供理论依据。     

白鲢鱼背侧肌焦磷酸酶的纯化及酶学特性

通过粗分离、50%～80%饱和度硫酸铵分级沉降、DE-52阴离子交换柱层析等步骤,从白鲢鱼背侧肌中分离纯化出焦磷酸酶。通过变性凝胶电泳分析,该酶在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱中仅有一个分子质量为40 kD的条带。酶学特性研究表明,白鲢鱼背侧肌焦磷酸酶可专一性地水解焦磷酸盐,反应初速率时间范围为0～15 min,最适反应温度为45 ℃,最适反应pH值为7.5。Mg2＋对该酶有明显的激活作用,在Mg2＋浓度为5 mmol/L时酶活力最高。5 mmol/L的Ca2＋、Zn2＋、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA）-Na2、EDTA-Na4、KIO3和1 mmol/L的NaF均对该酶有强烈的抑制作用。该酶水解焦磷酸四钠的最大反应速率为0.051 U/mg,米氏常数为0.54 mmol/L。     

发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶的提取

确定提取发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶的最佳方法和最佳提取条件。在单因素试验的基础上,采用多指标正交试验设计和综合平衡分析法研究溶菌酶结合非离子表面活性剂法提取发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶的裂解液成分和提取条件。结果表明：裂解液的成分为50mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、体积分数3% 吐温-20、2mg/mL 溶菌酶、pH8.9;提取条件为裂解液与菌体的比例10:1(V/m)、保温时间5h、保温温度37℃时酶比活力达38.957U/mg,此时可最大效率的获得发酵乳杆菌的细胞壁蛋白酶。     

Purification and characterization of pyrophosphatase from bighead carp (Aristichthys nobilis)

Pyrophosphatase (PPase, EC 3.6.1.1) responsible to the hydrolysis of pyrophosphate (PPi) in muscle was purified from bighead carp (Aristichthys nobilis), and characterized in detail herein for the first time. PPase was extracted with 20 mmol/L Tris-HCl buffer (pH 7.0) containing 0.05 mol/L KCl, followed by heat treatment and ammonium sulfate precipitation. Then it was purified by deithylaminoethyl-cellulose (DE52) and Sephacryl S-300 chromatography, subsequently resulted in a 114.5-fold purification. The molecular mass of the PPase was defined to be 50 kDa with two subunits. The optimum pH of the purified PPase was around 8.0, and its optimum temperature was confirmed to be 50 °C. Magnesium ion was necessary to the activity of PPase. An excess of PPi over Mg²⁺ resulted in inhibition of PPase. When the Mg²⁺/PPi molar ratio was 1:1, the maximal enzyme activity was obtained. In addition, PPase converted PPi to orthophosphate (Pi) stoichiometrically with a K_m of 1.98 mmol/L under the condition of 5 mmol/L Mg²⁺. Ethylene diamine tetraacetate (EDTA) activated the activity of PPase at low concentration, however, it consumingly did inhibit the enzyme activity at high concentration.     

樱桃谷鸭胸肉脂肪氧合酶的分离纯化及其酶学特性研究

用硫酸铵分级沉淀和DEAE-Sepharose柱层析法分离纯化樱桃谷鸭胸肉中脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX),同时对酶学性质进行研究。结果显示：在DEAE-Sepharose柱层析时,当NaCl洗脱浓度在0.3～0.35mmol/L时,LOX被分离出,LOX经过分离纯化后其纯化倍数可达到54.3,SDS-PAGE电泳显示其分子质量约为96kD;粗酶和纯酶性质略有不同;以亚油酸为底物,粗酶和纯酶的最适底物浓度分别为6.4、10mmol/L,最适反应温度分别为40、30℃,最适pH值分别是5.0、5.5;纯酶Km=1.139mmol/L、Vmax=0.07608U/min,纯酶与底物的亲和能力大于粗酶。     

液相色谱法快速测定鸡肉中氧氟沙星手性对映体残留量

建立了鸡肉样品中氧氟沙星对映体液相色谱荧光检测(liquid chromatography fluorescence detector,LC-FLD)残留量快速分析方法。鸡肉样品经磷酸盐缓冲液提取后,用C18固相萃取小柱净化,洗脱液吹干后用流动相复溶即可进行液相色谱分析。分析时采用LeapsilTM C18色谱柱,以水相(含2 mmol/L硫酸铜和2.5 mmol/L异亮氨酸,pH3.5)和甲醇作为流动相进行梯度分析,荧光检测器检测,其中激发波长为297 nm,发射波长为487 nm,外标法定量。本方法在5.0、50、100μg/kg和150μg/kg 4个添加水平下,左氧氟沙星对映体平均添加回收率在75.5%～86.1%之间,批内变异系数在1.97%～4.42%之间,批间变异系数在3.02%～6.02%之间;右氧氟沙星对映体平均添加回收率在77.3%～84.9%之间,批内变异系数在2.15%～4.21%之间,批间变异系数在3.87%～5.84%之间。方法对两种对映体的检测限均为1.5μg/kg,定量限均为5.0μg/kg。     

大豆过氧化氢酶的分离纯化及性质研究

新鲜大豆芽经匀浆、磷酸缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的过氧化氢酶。该酶酶活回收率为30.92%,纯化倍数为293.09,酶比活力达到26 322.43 U/mg。该酶全分子质量为234.9 kD,亚基分子质量为57.42 kD;最适pH值为7.2,最适温度为30 ℃,在pH 4.0～10.6及25～35 ℃范围内有较好的稳定性;在30 ℃、pH 7.2条件下测得该酶对过氧化氢的Km值为31.82 mmol/L;十二烷基硫酸钠、草酸、Ag+、Cu2+对该酶有强烈的抑制作用,Pb2+对该酶有双重作用,低浓度时有激活作用而高浓度时抑制酶活性。