应用光敏生物素标记探针检测杂交瘤细胞中小鼠白血病病毒

采用BamHⅠ酶切和琼脂糖凝胶电泳技术，从重组质粒pSF11中回收5kb小鼠白血病病毒（MuLv）DNA片段，用光敏生物素标记制备DNA探针，采用斑点杂交法检测杂交癌细胞，McAb纯品以及SP2／0细胞中的MuLv。结果表明，此探针特异性好，灵敏度可达25pg。在检测的13株杂交瘤细胞和2株SP2／0细胞中分别有5株和1株为MuLv阳性，在McAb纯品中未查出MuLv。     

PERT-ELISA法用于细胞逆转录病毒检测的再研究

目的进一步分析PERT-ELISA法在细胞逆转录病毒检测应用中的意义。方法分析不同细胞培养液及其添加成分对PERT-ELISA法检测结果的影响及检测方法的精密性和检测用试剂的稳定性,将该方法用于不同来源细胞的逆转录酶活性的检测,并通过共培养法对我国金黄地鼠肾细胞中逆转录酶活性是否具有感染性进行初步分析。结果不同细胞培养液及其添加成分逆转录酶活性检测均为阴性,不会影响样本的检测结果。PERT-ELISA法具有良好的试验间精密性及重现性,检测用试剂在保存条件下,至少在1年内可保持稳定。近250株细胞的检测结果显示,含有逆转录病毒颗粒的细胞,无论是否具有感染性,均为逆转录酶活性阳性;除部分人淋巴瘤来源的细胞外,大部分人源细胞为逆转录酶活性阴性;8种91株猴肾来源的细胞包括74株Vero细胞均为逆转录酶活性阴性;而鼠源细胞则大部分为阳性,其中20株CHO来源的细胞均为阳性;3株猪源细胞及1株猫源细胞为阳性,而2株水貂细胞、2株牛源细胞及1株犬源细胞均为阴性。被检测的15株组织工程产品用人源细胞逆转录酶活性均为阴性,而我国不同地区来源的金黄地鼠肾细胞上清中,逆转录酶活性均为阳性。金黄地鼠肾细胞与人2BS细胞共培养后连续传代7次,细胞上清中逆转录酶活性仍为阳性,但随着传代次数的增加呈下降趋势。结论PERT-ELISA法可用于细胞逆转录病毒的检测,但对于阳性细胞,还需要进一步分析其与逆转录病毒或逆转录病毒样颗粒的相关性及是否具有感染性。     

人恶性黑色素瘤A375细胞黑素刺激素受体(MC1R)的检测

目的检测人恶性黑色素瘤A375细胞膜上MC1R蛋白及其cDNA,为研究黑色素瘤细胞表面受体及靶向配体奠定基础。方法利用放射配体分析法检测人恶性黑色素瘤A375细胞膜上的MC1R蛋白;用RTPCR方法扩增人恶性黑色素瘤A375细胞MC1R的cDNA,并克隆至pMD18T质粒,进行酶切分析鉴定及扩增片段DNA序列测定。结果放射配体分析结果表明,125IαMSH可与人恶性黑色素瘤A375细胞膜特异结合。RTPCR结果显示,扩增产物的大小与MC1R的cDNA相符。测序结果证实扩增片段为MC1R基因的特异片段。结论证实人恶性黑色素瘤A375细胞膜上表达MC1R蛋白。MC1R基因的成功克隆为其进一步研究提供了必要条件。     

人溶菌酶cDNA在COS-1细胞及小鼠乳腺的暂态表达

目的研究自行克隆的1.5kb hLYZ双链cDNA的表达特性。方法将此cDNA亚克隆入真核表达载体pcDNA3及乳腺特异表达载体p205C3,重组载体pcDNA3LYZ转染COS-1细胞,用间接免疫荧光法检测转染细胞中hLYZcDNA的表达;重组载体p205C3LYZ注射哺乳期小鼠,用微球菌溶解试验和斑点杂交试验检测hLYZ cDNA在小鼠体内的表达。结果hLYZ cDNA在转染的COS-1细胞中得到了正确表达;小鼠体内表达并分泌到乳汁中的hLYZ达87μg/ml,且目的基因的表达具有较好的组织特异性。结论hLYZ cDNA可在COS-1细胞中有效表达,基因构件p205C3LYZ可以用于动物乳腺生物反应器研制。     

抗支原体共同抗原单抗的筛选及应用

利用猪鼻 (mhy)、肺炎 (mp)支原体作为免疫原 ,采用杂交瘤技术建立 7株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞。所分泌的抗体用ELISA法检测与Mo、Ma、Mhy、Al及Mp 5种支原体的反应性 ,其中甲H5和丁D3细胞所分泌的抗体与 5种支原体均发生反应。表明这两种抗体是针对 5种支原体共同抗原的 ;以丁D3抗体作为一抗 ,采用间接荧光法分别检测 5种支原体感染的Vero细胞均为强阳性 ,其敏感性高于培养法 ,与DNA染色法相当 (2 0 0个 /ml) ;以甲H5抗体为包被抗体 ,丁D3抗体为酶标抗体 ,采用双抗体夹心法检测培养上清中支原体敏感性为 12 5ng/ml。用两种方法检测 2 0份支原体阳性细胞株 ,10份阴性细胞株标本 ,结果间接荧光法显示 2 0份阳性标本全部为阳性 ,10份阴性标本 1份为阳性 ;双抗体夹心法 2 0份阳性标本中 10份为阳性 ,10份阴性标本全部为阴性     

抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段单克隆抗体的制备

目的制备抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段(sTRAIL)的单克隆抗体。方法用重组sTRAIL免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,捕获ELISA筛选阳性克隆,制备腹水抗体。间接ELISA测定单抗效价,并进行单抗亚类、特异性鉴定及杂交瘤细胞染色体和单抗识别位点分析。将杂交瘤细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后,检测细胞培养上清的效价。结果3株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgG1型,腹水单抗效价均高于10-6,杂交瘤细胞染色体数介于94～98条之间,均识别sTRAIL分子上线性表位。细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后的上清效价保持稳定。结论已成功制备了3株可稳定分泌抗sTRAIL单克隆抗体的杂交瘤细胞,为TRAIL的定性定量检测及组织表达分析奠定了基础。     

分泌抗HBsAg-抗HRP双特异单克隆抗体杂交-杂交瘤的建株

用分泌抗-HBs Ag单克隆抗体的杂交瘤细胞的8-氮杂鸟嘌呤(8-AG)耐受株作为亲本细胞,与辣根过氧化物酶(HRP)免疫的BALB/c小鼠脾细胞进行第2次融合,从382个克隆上清中筛选出一株分泌抗-HBs Ag-抗-HRP双特异抗体的阳性孔。经多次克隆纯化建立3株杂交-杂交瘤,命名为Bs33、Bs38和Bs39,其抗体均属Ig G_1型。细胞染色体平均为113条。细胞反复冻存、复苏、传代仍稳定分泌双特异抗体。     

应用光敏生物素探针检测Vero细胞乙脑疫苗中细胞残余DNA

用国产光敏生物素,标记Veto细胞全DNA,通过与疫苗中同源DNA的狭缝杂交,检测Vero细胞乙脑疫苗中细胞残余DNA含量。检测灵敏度可达1pg。探针稳定长达一年。杂交反应特:异性高,结果重复性好。与同位素探针相比,生物素标记探针简便、经济、快速、稳定。由本法测得,Vero细胞乙脑粗制疫苗中,含DNA为200～400pg/0.5ml;超滤浓缩苗为4×10~4～6×10~6pg/0.5ml;通过柱层析和沉淀法提纯的疫苗则分别低于60pg/0.5ml和1pg/0.5ml。本法同样适用于传代细胞制备的其它生物制品中细胞残余DNA的检测。     

应用核酸探针检测甲型肝炎疫苗的滴度

应用甲型肝炎病毒(HAV)cDNA 片段作为探针,分别以同位素、异羟基洋地黄毒苷配基和生物素标记该探针,对甲肝疫苗病毒培养过程中不同时期、不同接种量的病毒浓度进行了滴定,并以 ELISA 作对照。结果表明,各种标记探针检测的灵敏度均高于 ELISA。而不同标记的探针检测的结果无显著差异。     

脊髓灰质炎病毒减毒活疫苗中Ⅲ_2株全基因测序及序列分析

目的对脊髓灰质炎病毒减毒活疫苗中Ⅲ2株全基因进行测序,并与P3/Leon/37株和SabinⅢ株的全基因序列进行同源性比较。方法通过大片段克隆和小片段克隆两种方法,采用RT-PCR法扩增覆盖中Ⅲ2株基因组全长且互相重叠的4个大片段和8个小片段,基因组中间片段的PCR产物直接测序,基因组末端的片段先进行TA克隆再测序。分别将两种方法得到的c DNA片段进行拼接,并将所得全长c DNA序列与P3/Leon/37株和SabinⅢ株的全基因序列进行同源性比较。结果两种方法均能得到长度为7 432 bp的中Ⅲ2株全长c DNA序列,且碱基序列完全一致;中Ⅲ2株全基因序列与P3/Leon/37株和SabinⅢ株全基因序列的同源性均为99%;中Ⅲ2株与P3/Leon/37株的碱基序列差异共有19处(非编码区3处和编码区16处),编码区有6个基因突变导致氨基酸序列的改变;中Ⅲ2株和SabinⅢ株的碱基序列差异共有28处(非编码区13处和编码区15处),编码区有3个基因突变导致氨基酸序列的改变。结论中Ⅲ2减毒疫苗株全基因组c DNA序列为7 432 bp,与SabinⅢ株全基因序列的同源性为99%。     

鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)S1蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法用差速离心纯化的IBV四川分离株Sczy3免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。利用IBV鼠高免血清建立间接ELISA,筛选杂交瘤细胞。强阳性孔经有限稀释法亚克隆,获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备腹水。用鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单抗的亚型,Western blot法分析单抗的反应原性,ELISA法分析单抗的特异性及其与不同IBV毒株的交叉反应性。结果经连续4次亚克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗IBV Sczy3株单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C8C1和2C10E7,其腹水效价分别为1∶12 800和1∶25 600。2株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgM亚型;均可特异性识别S1蛋白;2株单抗只与IBV发生特异性反应,与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H9亚型和AIV H5抗原均不反应,与其他5种基因型的10株IBV毒株均可产生交叉反应。结论成功制备了2株IBV S1蛋白单克隆抗体,为IBV的检测、抗原表位筛选及致病机理的研究等提供了材料。     

鸡IL-18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的　以鸡脾细胞mRNA为模板扩增编码鸡IL 18成熟蛋白的cDNA ,并在大肠杆菌中进行表达。方法　用PHA和LPS激活的AA肉鸡脾细胞 ,提取mRNA ,以RT PCR法扩增出编码鸡IL 18成熟蛋白的cDNA并测序 ,与pET 2 8b载体构建重组质粒 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS中表达 ,用SDS PAGE检测表达产物。结果　所克隆的核苷酸片段包含了鸡IL 18全部成熟蛋白编码基因 ,其大小为 5 0 7个核苷酸 ,编码 16 9个氨基酸 ;构建的重组表达载体在大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS中表达出相对分子质量为 190 0 0的重组蛋白。结论　已成功克隆和表达了鸡IL 18成熟蛋白基因。     

传染性法氏囊病病毒疫苗B87株基因组B节段的克隆和序列分析

目的获得传染性法氏囊病病毒(IBDV)疫苗B87株B节段全长cDNA,并对其序列进行分析,为进一步在分子水平上研究病毒基因组的功能、抗原变异和毒力变异奠定基础。方法使用蛋白酶K和酚/氯仿抽提法提取病毒基因组RNA,用LiCl分级沉淀方法纯化病毒基因组dsRNA,通过RT-PCR一步扩增获得B节段的全长cDNA。将其克隆到pGEM-T载体上,然后测序,并用DNAStar软件进行序列分析。结果测序结果表明,克隆的B87株基因组B节段全长为2827bp,与超强毒参考株UK661和HK46的同源性分别为89.8%和89.3%,与强毒参考株Harbin-1和ZJ2000的同源性分别为90.2%和89.5%;与变异毒株GLS的同源性为97.8%;与弱毒参考株CEF94和Gt株的同源性均为99.8%,与P2株的同源性达100%。结论通过对9株IBDV编码氨基酸序列进行分析、比较,推测B节段上10个独特的氨基酸位点可能与毒力相关。     

Apg-2基因沉默对BaF3-MIGR1及BaF3-P210细胞增殖的影响

目的探讨Apg-2基因沉默对pMIGR1空载体感染的BaF3-MIGR1细胞及稳定表达Bcr-Abl融合基因的BaF3-P210细胞增殖的影响,为进一步研究Apg-2在Bcr-Abl阳性的CML细胞中的作用奠定基础。方法针对Apg-2基因609～629、845～865和2 110～2 130核苷酸合成3条shRNA序列Hspa41、Hspa42、Hspa43,同时合成阴性对照序列HspaHK,电穿孔转染BaF3-MIGR1和BaF3-P210细胞,经G418筛选稳定抑制细胞株,RT-PCR和Western blot检测细胞中Apg-2基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平;Am-blue法检测细胞增殖;甲基纤维素法检测细胞克隆形成能力;流式细胞技术检测细胞周期的变化。结果转染的3条shRNA质粒中,shRNA-Hspa42的干扰效果最佳。Apg-2表达抑制后,BaF3-P210细胞的增殖与克隆形成能力均明显下降(P<0.05),处于G1期细胞的百分率明显升高(P<0.05),处于S期的细胞百分率明显下降(P<0.05);而BaF3-MIGR1细胞的增殖与克隆形成能力均明显增强(P<0.05),处于S期的细胞百分率明显升高(P<0.05)。结论干扰Apg-2基因的表达可抑制Bcr-Abl阳性细胞BaF3-P210的增殖,而对Bcr-Abl阴性细胞BaF3-MIGR1的增殖起促进作用。     

生物素-亲和素-DNA纳米颗粒信号放大检测载体的构建

目的构建用于检测细菌、病毒等病原体DNA的生物素-亲和素纳米颗粒信号放大载体。方法设计并合成两端和一端标记生物素的寡核苷酸探针(2B/1B-DNA),与抗生蛋白链菌素葡聚糖(Poly-STV)通过生物素与亲和素作用,偶联形成大分子纳米网状颗粒,并筛选最佳探针类型及其长度、2B-DNA和Poly-STV的浓度及比例和反应条件。结果2B-DNA和Poly-STV形成纳米颗粒信号放大载体的最佳浓度分别为1μmol/L和5μmol/L,最佳浓度比为1∶5,2B-DNA长度为60bp,缓冲液为Buffer B,反应条件为55℃,800r/min,20min。结论已成功构建了生物素-亲和素大分子纳米颗粒,可作为DNA检测信号放大技术的备选载体。     

骨形态发生蛋白9对食管鳞状细胞癌细胞的抑制作用

目的探讨骨形态发生蛋白9(Bone morphogenetic proteins 9,BMP9)对食管鳞状细胞癌细胞增殖、克隆、迁移、侵袭及细胞周期的影响。方法用AdGFP和AdBMP9分别感染3株食管鳞状细胞癌细胞株ECA109、KYSE150和KYSE180,并设不感染病毒的3种细胞作为对照,采用RT-PCR法检测AdBMP9感染的3株细胞中BMP9基因mRNA的转录水平,MTT法检测病毒感染细胞0⁹6 h各组细胞的增殖活力,平板克隆法检测各组细胞的克隆形成能力,划痕试验检测各组细胞的迁移能力,Transwell小室试验检测各组细胞的侵袭能力,并对3组ECA109细胞进行细胞周期的检测。结果 AdBMP9感染的3株细胞中BMP9基因mRNA的转录水平均明显提高。与AdGFP感染和未感染病毒的细胞相比,3种细胞在过表达BMP9后,增殖活力明显降低(P<0.05);细胞克隆形成能力均下降(下降率达70%以上),且克隆细胞团明显变小;细胞迁移和侵袭能力均下降;AdBMP9感染的ECA109细胞处于G1期的细胞比例明显上升,S期比例明显下降(P<0.05)。结论 BMP9可明显抑制食管鳞癌细胞的增殖、克隆、迁移和侵袭能力,并将细胞周期阻滞于G1期。     

阈值法检测人用狂犬病疫苗宿主细胞DNA残留量

目的建立人用狂犬病疫苗宿主细胞DNA残留量的阈值检测法,并进行验证。方法验证阈值法的线性范围、准确性及精密度。采用阈值法和DNA探针杂交法分别对3批狂犬病疫苗原液样品宿主细胞DNA残留量进行测定,并进行比较。结果 DNA标准品浓度为3～200 pg时,与检测信号(μV/s)呈良好的线性关系,直线回归方程为y=10. 812 x-36. 761,R2=0. 994 5;加入100和25 pg DNA标准品的样品回收率为88%～110%,CV分别为7. 7%和7. 4%;精密度各次检测CV均10%。阈值法检测3批狂犬病疫苗原液样品宿主细胞DNA残留量分别为181. 9、104. 2和64. 6 pg/mL,DNA探针杂交法检测结果分别为约250、约100和100 pg/mL,二者检测结果相符。结论阈值法有望应用于生物制品宿主细胞残留DNA含量的常规检测,且具有良好的准确性及精密度。     

我国黄热减毒活疫苗的均匀性分析

目的分析我国黄热减毒活疫苗的均匀性。方法采用重量法测定同批疫苗的装量差异;空斑法测定同批号10支疫苗之间的病毒滴度差异;挑取20个病毒空斑,分析这20个空斑病毒亚克隆株的生长特点和空斑形态的一致性,并选取其中4个亚克隆株进行全基因组序列测定,比对分析不同亚克隆株的基因突变情况。结果同批黄热减毒活疫苗装量差异为-3. 4%～2. 83%;同批号10支疫苗的病毒滴度几何均数为5. 12 LgPFU/mL,SD为0. 16 LgPFU/mL,CV为3%;20个空斑病毒均在传代后第5天引起■的细胞病变;同一时间收获的20个空斑病毒的病毒滴度均大于7. 0 LgPFU/mL,CV为2%;20个空斑病毒亚克隆株所形成的空斑与疫苗空斑形态相似;2个空斑病毒未发生任何有义突变,1个空斑病毒发生了1个有义突变(NS5),1个空斑病毒发生了5个有义突变,其中4个位于非结构蛋白,1个位于C蛋白。结论无论是从装量差异、病毒滴度差异、疫苗不同空斑病毒亚克隆株表型和基因型的差异,我国黄热减毒疫苗均表现出了良好的均匀性。     

治疗性肝癌单克隆抗体HAb18生产用种子细胞的质量控制

目的进行治疗性肝癌单克隆抗体HAb18生产用种子细胞的质量控制研究。方法用细胞计数、ELISA和FCM分别检测细胞生长、抗体生成速度和抗原结合活性;冻存细胞复苏后及体外传代3个月,检测抗体分泌稳定性和克隆阳性率;进行无菌检查、细胞核型和同工酶谱分析,了解细胞遗传稳定性、外源因子污染和细胞间交叉污染情况。结果肝癌单克隆抗体HAb18生产用种子细胞的细胞生长和抗体生成速度分别为0.047~0.052/h和1.1~1.4 pg/cell.h,与靶细胞FHCC98结合的阳性率达99%,平均荧光强度在200以上。冻存细胞复苏后及体外连续传代3个月后,其特异性抗体生成速度维持在1.0 pg/cell.h以上,培养上清抗体效价仍为1∶1 000。不同批次的生成细胞核型均符合杂交瘤细胞特征,外源因子检查阴性,无细胞间交叉污染。结论HAb18生产用种子细胞的细胞生长和抗体生成速率、抗体稳定性和特异性均符合已建立的规模化放大培养的种子细胞质控标准。