TIMP—2基因转染对高转移性人巨细胞肺癌细胞系生物学行为的影响

探讨金属蛋白酶组织抑制因子ＴＩＭＰ－２对肿瘤恶性表型的逆转作用及其在肿瘤基因治疗上的意义。方法利用基因重组技术构建了含全长ＴＩＭＰ－２ｃＤＮＡ的真核表达载体，用脂质体法转染高转移性人肺癌细胞（ＰＧ），检测转染后ＰＧ细胞的金属蛋白酶（ＭＭＰｓ）活性、体外侵袭、裸鼠体内成瘤性及转移能力等多项生物学行为的变化。并以ＴＩＭＰ－２基因转染前后ＰＧ细胞的裸鼠皮下移植瘤为研究对象，利用免疫组织化学和原位杂交方法，研究在整体环境下ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９和ＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２的ｍＲＮＡ及蛋白表达情况。结果转染细胞较母系细胞ＴＩＭＰ－２ｍＲＮＡ表达增强，ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９的产生及活性无明显变化，体外增殖能力增强，但体外侵袭和软琼脂集落形成能力以及裸鼠体内成瘤性及自发转移能力下降。此外，ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９和ＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２在ＰＧ细胞之裸鼠皮下移植瘤的间质细胞及肿瘤细胞均有表达，阳性的肿瘤细胞主要位于肿瘤和间质交界处。结论特异性上调ＴＩＭＰ－２基因的表达可在一定程度上逆转ＰＧ细胞的恶性表型。     

金属蛋白酶MMP-9表达与人黑色素瘤细胞系转移表型的相关性

目的 :探讨金属蛋白酶MMP 9与肿瘤转移的相关性。方法 :利用基因重组技术构建反义MMP 9cDNA真核表达载体 ,用脂质体法转染MMP 9高表达的转移性人黑色素瘤细胞株WM 45 1,检测转染后细胞MMP 9表达水平的改变以及体外生长、侵袭、裸鼠体内成瘤及自发转移能力的变化。结果 :转染细胞MMP 9的表达及活性明显下降 ,同时MMP 2的表达也受到一定抑制 ,细胞生长速度、体外侵袭能力及裸鼠体内成瘤性及自发转移能力均受到一定程度抑制。结论 :通过反义RNA技术下调MMP 9的表达 ,可使人黑色素细胞转移能力受到一定程度的抑制 ,说明MMP 9在人黑色素瘤细胞转移过程中起重要作用     

TIMP－1基因转染对人肺巨细胞癌细胞系生物学行为的影响

利用基因重组技术构建了一个含有全长人ＴＩＭＰ－１ｃＤＮＡ的真核表达重组体。重组质粒通过脂质体法导入高转移入肺巨细胞癌细胞系（ＰＧ细胞）。随机挑选５个Ｇ４１８抗性克隆，并对其中的两个克隆ＰＧ－Ｔ２和ＰＧＴ４进行了深入的研究。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹表明，这两个克隆具有较高的ＴＩＭＰ－１ＲＮＡ表达，其表达水平明显高于ＰＧ细胞和空载体转染对照细胞ＰＧ－ＭＶ。ＰＧ－Ｔ２和ＰＧ－Ｔ４克隆细胞显示出很高的ＴＩＭＰ－１蛋白活性，相同条件下ＰＧ和ＰＧ－ＭＶ未能显示出具有ＴＩＭＰ－１蛋白活性。此外，与其母系ＰＧ细胞及空载体转染对照细胞ＰＧ－ＭＶ相比，ＴＩＭＰ－１转染细胞的增殖速度和侵袭能力明显下降，其在软琼脂上形成克隆和在裸鼠体内成瘤的能力丧失。提示ＰＧ细胞中ＴＩＭＰ－１基因的特异性上调不仅能抑制其侵袭能力，而且对其增殖和成瘤产生抑制作用。     

可调控型反义MMP-9表达与恶性肿瘤转移表型的相关性研究

目的探讨金属蛋白酶MMP-9与肿瘤转移的相关性。方法利用基因重组技术构建反义MMP-9cDNA四环素可调控表达载体,用脂质体法转染反义MMP-9至转移性人黑色素瘤细胞株WM451(高表达MMP-9)。检测转染后细胞MMP-9表达水平的改变以及裸鼠体内成瘤及自发转移能力的变化。结果转染反义基因后,WM451细胞MMP-9的表达及活性明显下降,体外侵袭能力及裸鼠体内成瘤性及自发转移能力均受到一定程度抑制;运用四环素可以抑制四环素负调控逆转录病毒载体上的外源基因的表达。结论反义MMP-9基因下调MMP-9的表达,可使人黑色素细胞转移能力受到一定程度的抑制,说明MMP-9在人黑色素瘤细胞转移过程中起重要作用。同时,四环素负调控逆转录病毒载体可以调控外源基因的表达。     

肿瘤相关抗原CHP2促进HEK293细胞在裸鼠腹腔内的转移

目的：研究肿瘤相关抗原CHP2对HEK293细胞在裸鼠腹腔内转移能力的影响,并初步探讨其可能的分子机制。方法：通过Boyden小室法检测CHP2转染细胞和对照细胞的体外转移能力。对BALB/c裸鼠进行腹腔接种,观察裸鼠体内的成瘤与组织浸润情况并进行HE染色。利用RT-PCR方法检测HEK293细胞中部分转移相关分子的基因表达水平。结果：CHP2增强HEK293细胞在体外穿过Matrigel胶的侵袭能力,同时显著加速HEK293细胞在裸鼠腹腔内的成瘤速度并促进肿瘤对腹腔主要脏器的浸润。CHP2上调转移相关分子骨桥蛋白（osteopontin,OPN）在HEK293细胞中的表达,但对基质金属蛋白酶MMP2的表达没有明显影响。结论：CHP2显著增强HEK293细胞在体外及裸鼠腹腔内的转移能力,OPN表达上调可能参与CHP2对HEK293细胞的转移促进作用。     

野生型P53对胃癌细胞系的生长抑制作用

目的；观察野生型Ｐ５３对胃癌细胞系的生长抑制作用，方法，以逆转录病毒为载体将野生型Ｐ５３基因导入胃癌细胞系ＭＫＮ２８和ＢＧＣ８２３，检测Ｐ５６３对肿瘤细胞的影响。结果：Ｐ５３在转染细胞中表达水平提高，外源性Ｐ５３的导入使肿瘤细胞增殖细胞抗原（ＰＣＮＡ）水平明显降低；Ｇ０／Ｇ１期细胞数增加，Ｓ期降低。转染Ｐ５３基因的ＭＫＮ２８细胞裸鼠体内成瘤能力明显下降。结论野生型Ｐ５３基因在与调节ＤＮＡ复制及细胞     

HepG2细胞系皮下接种与肝原位接种成瘤的比较研究

目的 探讨皮下接种成瘤与原位接种成瘤在内环境不同情况下对肿瘤生长、侵袭转移能力的影响.方法 选取人肝癌细胞系HepG2进行体外培养.将BALB/c裸鼠随机分为皮下瘤接种、肝脏原位细胞接种两组.观察裸鼠成瘤率、裸鼠存活率、肿瘤生长速度、肿瘤病理学特点及远处脏器转移.结果 HepG2细胞体外生长状态良好,增殖活跃.皮下接种成瘤率100%,肿瘤呈结节状膨胀性生长,对周围组织有侵袭,但无转移.肝脏原位细胞接种组成瘤率100%,肿瘤呈结节状膨胀性生长,对周围肝组织和腹壁有侵袭,肝内转移率70%,肺转移50%.结论 HepG2细胞皮下和肝原位接种易成瘤,可用于肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)体内研究的实验模型.如果进行HCC的侵袭转移的机制及药物干预治疗等方面的研究,肝原位接种成瘤更能模拟人类肿瘤生长的条件.     

CXCR4基因沉默对黑色素瘤侵袭和转移影响的实验研究

目的 探讨CXCR4基因沉默对黑色素瘤侵袭及转移的影响及可能机制。方法 设计合成CXCR4特异性短发夹状RNA(shRNA)插入pSilencer载体,转染人高转移性黑色素瘤细胞株MV3、RT-PCR和Western blot法检测shRNA对靶基因CXCR4表达的影响。利用Transwell小室模型检测细胞体外侵袭能力,MTT法检测细胞体外增殖能力。通过裸鼠尾静脉瘤细胞注射,将转染后的细胞接种至裸鼠皮下,构建黑色素瘤转移模型,观察肿瘤生长情况。结果 CXCR4-shRNA能有效下调CXCR4基因的表达,降低黑色素瘤细胞增殖、体外侵袭及转移能力。RT-PCR及细胞免疫荧光显示,转染CXCR4-shRNA的黑色素瘤瘤MV3细胞系MMP-2表达下调;免疫组化结果显示,实验组裸鼠黑色素瘤瘤体及转移灶组织MMP-2的表达低于对照组。结论 shRNA介导的CXCR4基因沉默在体外实验能够显著抑制黑色素瘤细胞的生长和增殖活性,减弱体外侵袭能力,且体外产生抑瘤效应,明显降低肝、脑器官转移能力和定向肺转移能力。其机制可能与SDF-1/CXCR4信号途径阻断,进而抑制MMP-2的表达有关。     

外源p53基因和TNFa基因转导对膀胱癌细胞在裸鼠体内的生长抑制

通过逆转录病毒载体将野生型ｐ５３基因、ＴＮＦａ基因单独或与ＩＬ－６基因连接（ＴＮＦＩＬ－６）分别导入膀胱癌细胞株ＥＪ和ＢＩＵ－８７．裸鼠致瘤试验和体外生长实验显示：ｐ５３基因转染组细胞接种裸鼠后９周无肿瘤生长，体外生长速率明显降低，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交显示Ｈ－ｒａｓ基因表达明显低于非转染组细胞，ＴＮＰａ基因和ＴＮ刊ＩＬ－６基因转染组裸鼠瘤体积明显小于对照组，体外生长速率与对照组无显著差别，两种细胞因子对Ｈ－ｒａｓ基因表达无影响。     

野生型p53基因对胰腺癌细胞的抑制作用

目的：观察人类野生型p53（wtp53）基因对人胰腺癌细胞的抑制作用。方法：用逆转录病毒为载体将外源性wtp53基因导入人胰腺癌细胞系PC－2，通过体外及小鼠体内实验研究转入基因的表达及对肿瘤的抑制作用，结果：p53在转染细胞PC－2／p53中表达水平提高，外源性wtp53基因的导入和表达能使PC－2细胞的生长速率减低，软琼脂集落形成能力下降，G0＋G1期细胞比例增加，凋亡指数升高，裸鼠体内成瘤能力明显下降，结论：逆转录病毒载体介导的外源性野生型P53能抑制人胰腺癌细胞生长。     

反义6A8cDNA转染肿瘤细胞生物学行为的研究

目的 探讨反义６Ａ８对肿瘤细胞恶性行为的影响。方法 选用来自人鼻咽癌细胞系ＣＮＥ－２Ｚ的高转移克隆ＣＮＥ－２１２细胞,分别用ｐＲＣ／ＣＭＶ－反义６４８ｃＤＮＡ表达载体及空质粒转染并检测了反义６Ａ８ｃＤＮＡ转染,空载体转染及未转染细菌自身及基质的粘附性,运动性和水解酶活性,体外侵袭性及体内生长转移能力。     

Nanog过表达对宫颈癌细胞分化程度的影响

目的:研究Nanog过表达对宫颈癌Hela细胞分化程度的影响。方法:体外合成Nanog mRNA并转染Hela细胞,使其过表达Nanog。检测转染后Nanog蛋白的表达、体外侵袭、迁移、体内成瘤及肿瘤干细胞球形成能力。结果:转染mRNA后,Hela细胞Nanog表达明显升高,体外侵袭和迁移能力明显提高。接种至裸鼠后成瘤能力也明显增强。经无血清培养液诱导后形成的肿瘤球明显多于正常对照组,且球的体积较大。肿瘤球细胞表达Nanog及CD133,进一步诱导可以分化为脂肪细胞。RT-PCR检测多能性相关基因的表达,发现转染Nanog mRNA可以激活内源性的Nanog,OCT4,Sox2及Fox D3。结论:Nanog可能通过调节多能性相关基因的表达来影响宫颈癌细胞的分化程度。     

脑胶质细胞瘤体内侵袭性的实验研究

目的 探讨胶质瘤的体内侵袭和转移特性。方法 利用体外转染有绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因的大鼠Ｃ６脑胶质瘤细胞移植模型,将携有增强型绿色荧光蛋白（ＥＧＦＰ）基因的pＥＧＦＰ－N３质粒体外转染Ｃ６细胞,筛选能稳定表达ＧＦＰ的瘤细胞克隆,并做流工细胞仪和电镜检测。将阳性转染和未转染瘤细胞以立体定向法植入ＳＤ大鼠脑实质仙,建立大鼠移植瘤模型。４周后处死大鼠并作脑连续石蜡切片,相邻切片分别行苏木素－伊红（ＨＥ）及免疫组织化学染色和荧光显微镜（激发光波长为４８８mm)检测。对移植瘤细胞行原代培养,以检测荧光基因在体内的保存情况。结果 阳性转染的Ｃ６瘤细胞的ＥＧＦＰ在大鼠脑内获得稳定表达,在荧光显微镜下较易于区分肿瘤与非肿瘤区,并能发现侵袭至远处的单个瘤细胞,其敏感性及特异性明显优于ＨＥ染色或免疫组化方法。结论 ＧＦＰ基因体外转染Ｃ6胶质瘤细胞并行大鼠脑内移植,是一种较好的研究脑胶质瘤侵袭性的体内实验模型。     

EZH2对人喉鳞状细胞癌HEP-2增殖、迁移和侵袭的影响

目的：探讨Zeste基因增强子同源物2(EZH2)在人喉鳞状细胞癌组织和HEP-2、SCC10A细胞中的表达及其对人喉鳞状细胞癌细胞HEP-2增殖、迁移和侵袭的影响。方法：收集宣城中心医院30例喉鳞状细胞癌和10例癌旁正常喉黏膜组织标本,qRT-PCR检测喉鳞状细胞癌组织和癌旁组织以及喉鳞状细胞癌细胞HEP-2、SCC10A中EZH2的表达。采用Lipofectamine2000将EZH2 shRNA质粒转染至HEP-2细胞中,通过qRT-PCR和Western blot检测EZH2 shRNA的转染效率,并通过Western blot检测EZH2下游相关信号分子的表达水平。CCK8实验检测HEP-2细胞的增殖,划痕实验和 Transwell侵袭实验检测细胞的迁移、侵袭能力。运用裸鼠体内成瘤实验检测EZH2对HEP-2细胞体内成瘤能力的影响。结果：EZH2在喉鳞状细胞癌组织及细胞中显著高表达(P＜0.01)。EZH2 shRNA质粒转染后可抑制细胞的增殖能力,细胞的迁移和侵袭也均受到明显抑制。裸鼠体内成瘤实验结果显示,EZH2 shRNA组的HEP-2细胞肿瘤形成能力明显减弱。结论：EZH2在喉鳞状细胞癌组织和细胞中高表达;EZH2 shRNA能够在体外抑制喉鳞状细胞癌细胞HEP-2的增殖、迁移和侵袭,并抑制RAF1-ERK信号通路的活化;EZH2能够在体内抑制喉鳞状细胞癌细胞HEP-2的成瘤能力。     

α_2-巨球蛋白对黑色素瘤细胞作用的体外实验研究

研究α２－巨球蛋白（α２Ｍ）对体外培养黑色素瘤细胞增殖、侵袭能力和组织蛋白酶Ｄ活力的影响。采用镜下计数，检测侵袭粘附在内皮细胞上３Ｈ－ＴｄＲ标记瘤细胞的放射性和比色测定组织蛋白酶Ｄ活性。结果：α２Ｍ可抑制瘤细胞生长、集落形成、侵袭能力和组织蛋白酶Ｄ活力。结论：α２Ｍ具有明显的抗肿瘤细胞增殖及转移能力，值得进一步研究以期应用于临床。     

共刺激信号B7—1表达对小鼠肿瘤细胞生长和转移的影响

为Ｂ７１分子基因在肿瘤免疫基因治疗中的应用提供实验依据。方法通过逆转录病毒介导的基因转移技术，将Ｂ７１ｃＤＮＡ导入具有不同免疫原性的小鼠肿瘤细胞获得表达，并观察转基因细胞在纯系小鼠体内生长和转移的改变。结果由于Ｂ７－１基因的转导表达，使具有免疫原性的ＥＬ４Ｔ淋巴瘤细胞致瘤性丧失；使非免疫原性的Ｂ１６黑色素瘤、Ｐ８１５肥大细胞瘤和ＭＡ８９１乳腺癌细胞的致瘤性减弱；使Ｂ１６细胞的实验性转移和ＭＡ８９１细胞的自发肺转移能力降低。通过转导Ｂ７－１基因的Ｂ１６细胞的免疫接种，可使再次接种的亲本Ｂ１６细胞的致瘤性减弱：但对已生长的亲本Ｂ１６细胞影响不明显。结论Ｂ７１基因导入不同的肿瘤细胞后，可引起机体产生不同程度抗肿瘤免疫反应，使肿瘤细胞在体内的生长和转移能力丧失或减弱，这种反应的强弱与肿瘤细胞本身的特性有关。     

细胞间粘附分子-1在人胃癌裸鼠移植瘤中的表达

目的 探讨胃癌细胞产生的细胞间粘附分子－１（ＩＣＡＭ－１）在胃癌侵袭和转移中的作用。方法 得用层粘蛋白的粘附性,筛选出对Ｌａｍｉｎｉｎ高粘附力（Ｌｍ＋）和低粘附力（Ｌｍ－）的两种不同胃癌细胞ＭＫＮ４５亚株,并接种于裸鼠体内,以免疫组化法观察裸鼠移植瘤组织中ＩＣＡＭ－１的表达。结果 Ｌｍ＋瘤块ＩＣＡＭ－１表达高于Ｌｍ－瘤块,阳性染色细胞主要位于瘤块边缘或瘤块离散边缘。结论 胃癌细胞ＩＣＡＭ－１的表达     

靶向IGF-1基因的siRNA抑制胶质瘤生长的体内外实验研究

目的观察靶向IGF-1基因的小干扰RNA（siRNA）在体内和体外对胶质瘤生长的抑制作用。方法采用逆转录．聚合酶链反应（RT-PCR）和Western印迹测定干扰后IGF-1的表达水平；采用Transwell体外侵袭试验进行细胞体外的侵袭力分析；用流式细胞仪检测细胞凋亡率；应用裸鼠成瘤实验测定IGF-1基因表达下调后胶质瘤C6细胞在体内致瘤能力的改变。结果靶向IGF-1基因的siRNA可以有效抑制IGF-1基因的表达，使IGF—1 mRNA表达减少50％～80％，蛋白表达减少60％，流式细胞术检测细胞凋亡率明显提高（P〈0．01），降低了在裸鼠体内成瘤的能力。结论siRNA介导的IGF-1基因下调可明显抑制胶质瘤细胞的生长。IGF-1可以作为胶质瘤基因治疗的一个新的靶点。     

外磁场引导定位秋水仙碱－磁微粒对裸鼠乳腺癌的抑制作用

作者用白蛋白包埋法制成具有磁响应的秋水仙碱－白蛋白－磁微粒，并采用ＭＴＴ法检测了秋水仙碱－白蛋白－磁微粒及游离秋水仙碱对ＥＭＴ＿６细胞的生长抑制作用，对乳癌ＥＭＴ＿６细胞裸鼠移植瘤进行基底部注射和外加磁场定位治疗．结果表明：秋水仙碱－白蛋白－磁微粒及游离秋水仙碱在体内、体外实验均对肿瘤细胞有明显的杀伤作用，体外实验在１００μｇ／ｍｌ剂量时，灭活率分别为５６．１６％和５８．４６％．对乳癌ＥＭＴ＿６细胞裸鼠移植瘤的抑瘤率分别为３２．８％和２３．６％，提示秋水仙碱－磁微粒外加磁场引导定位对裸鼠乳腺癌有较好的抑制作用．     

金属蛋白酶类及层粘连蛋白受体与人黑色素瘤细胞侵袭转移 …

目的：揭示金属蛋白酶类（ＭＭＰｓ）及层粘连蛋白受体（ＬＮ－Ｒ）与人黑色素瘤细胞侵袭转移的关系，并探讨ＭＭＰｓ及ＬＮ－Ｒ用以判断肿瘤细胞侵袭转移的可能性。方法：通过流式细胞术（ＦＣＭ）定量研究和蛋白酶活性分析，对具有不同潜在转移能力的人黑色素瘤细胞系（ＷＭ３５，ＷＭ１３４１ｂ，ＷＭ９８３ａ，ＷＭ４５１）进行ＭＭＰｓ及瘤细胞表面６７０００ＬＮ－Ｒ的荧光阳性率和全部细胞的平均荧光强度测定。结果：早期ＷＭ