人肝癌细胞转移相关蛋白膜联蛋白Ⅱ的筛查与分析

目的应用糖组学方法筛查肝癌转移相关的异常核心岩藻糖基化蛋白,分析膜联蛋白Ⅱ（annexinⅡ）与肝癌细胞转移的关系。方法双向电泳（2-DE）、凝集素亲和印迹及沉淀联合质谱筛查并验证肝癌转移相关核心岩藻糖基化蛋白；实时荧光定量PCR、细胞免疫荧光和Western blot测定annexinⅡ基因和蛋白表达。结果不同转移潜能人肝癌细胞有核心岩藻糖基化蛋白差异表达,鉴定并验证annexinⅡ岩藻糖基化与肝癌转移相关；它分布于细胞质,在MHCC97-L和MHCC97-H中基因和蛋白质表达较Hep3B高。结论AnnexinⅡ转录、翻译水平和核心岩藻糖基化增加可能与肝癌转移潜能相关。     

肝癌转移相关的骨桥蛋白表达及其糖基化的改变

目的 检测骨桥蛋白(OPN)在不同转移潜能肝癌细胞株及肝癌组织中的蛋白表达水平及其糖基化水平,探讨OPN糖基化改变与肝癌转移的相关性及其意义. 方法 用免疫组织化学和Western blot法检测人肝癌组织(非转移组6例、转移组7例)及不同转移潜能人肝癌细胞株(L02、Hep3B、MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6)中OPN蛋白水平;采用免疫沉淀技术纯化肝癌组织中的OPN蛋白,并采用多重凝集素印迹技术检测转移与非转移肝癌组织中OPN糖基化水平差异.数据统计采用t检验和方差分析.结果 OPN在不同转移潜能肝癌细胞株的表达差异具有统计学意义(F=5.04,P＜0.01).在肝癌组织中,转移组OPN蛋白表达水平明显高于非转移组(t=2.447,P＜0.05),相对吸光度值分别为0.69±0.21和0.45±0.14.免疫沉淀技术成功纯化肝癌组织中的OPN蛋白,后续的凝集素印迹结果显示:与非转移组相比,转移组OPN蛋白对凝集素朝鲜槐、红腰果E型、蔓陀罗、刀豆素A的亲和力较低(P值均＜0.05).结论 OPN蛋白表达水平与肝癌转移潜能增强呈正相关;OPN蛋白的α2,3-唾液酸、平分型GlcNAc、多天线、偏二天线的糖链、高甘露糖型N-糖等糖基化水平改变可能与肝癌转移潜能增高有关.     

膜-细胞骨架联接分子ezrin对肝癌细胞系生长和侵袭能力的影响

目的探讨膜-细胞骨架联接蛋白ezrin在肝细胞肝癌生长和转移过程中的作用。方法分别应用免疫荧光、逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和Western blot检测ezrin和骨架蛋白在不同转移潜能肝癌细胞系中的表达。选取高转移潜能SF7721（SMMC-7721经转基因后稳定表达肝细胞生长因子，从而获得高转移潜能的细胞系）和MHCC97-H细胞系为研究对象。通过RNA干扰技术下调SF7721和MHCC97-H细胞系中ezrin蛋白的表达，观察其运动和侵袭能力的变化：通过四甲基偶氮唑盐检测细胞增殖能力变化；电子显微镜观察细胞伪足；Transwell检测细胞的运动侵袭能力。结果免疫荧光显示ezrin和骨架蛋白表达于细胞质，且双色荧光证实两者存在共表达，高转移潜能细胞系SF7721。MHCC—I、MHCC97-Hezrin和骨架蛋白的表达明显高于低转移潜能细胞系SMMC-7721、Hep3B、HepG2细胞（x^2=13．277，P=0．010；x^2=21．815，P〈0．01）。D-肌动蛋白在高低转移潜能细胞系的表达差异无统计学意义。通过RNA干扰技术抑制ezrin蛋白表达后。SF7721和MHHC97-H的细胞的增殖和侵袭能力均显著下降。结论ezrin和骨架蛋白的过表达与肝癌的转移潜能相关，通过下调ezrin的表达可明显抑制肝癌细胞系SMMC-7721和MHCC97-H细胞的增殖和运动侵袭能力。     

不同转移潜能人肝癌细胞系酪氨酸磷酸化蛋白质差异分析

目的研究不同转移潜能人肝癌细胞系中酪氨酸磷酸化蛋白质表达的差异并筛查与肝癌转移相关的酪氨酸磷酸化蛋白质分子。方法应用双电泳(2-D E)、免疫印迹法及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析,对三种不同转移潜能人肝癌细胞系Hep 3B、MHCC97L和MHCC97H进行酪氨酸磷酸化蛋白质组分析。结果对照2-DE胶和免疫印迹发光胶片,Hep3B检测到10个点,MHCC 9 7L检测到19个点, MHCC97H检测到17个点。经质谱鉴定,得到膜连蛋白Ⅰ等19个差异点。结论细胞内酪氨酸磷酸化蛋白的表达差异与肝癌的侵袭转移有关。     

人肝癌细胞系Slit/Robo启动子甲基化状态及基因表达的研究

目的 研究Slit/Robo信号通路相关基因Slit1、Slit2、Slit3和Robo1、Robo3在多种人肝癌细胞系中的表达及甲基化状态,探讨与肝癌发生和发展的关系. 方法提取9种人肝细胞癌细胞株(Hep3B、HepG2、PLC/PRF/5/PRF/5、SMMC-7721、BEL-7402、MHCC97-H,MHCC97-L、LM3、LM6)及对照细胞株L02的基因组DNA和总RNA,采用半定量逆转录聚合酶链反应技术和甲基化特异性聚合酶链反应技术检测Slit1、Slit2,Slit3和Robo1,Robo3基因的基因表达水平与启动子甲基化状态.实验数据应用Paired t检验. 结果 Slit1、Slit2、Slit3基因除个别细胞株外,在不同转移潜能细胞株中均发生了DNA甲基化,同时Slit1和Slit3在mRNA水平几乎均不表达,Slit2基因表达程度在不同转移潜能的细胞株之间存在差异,随着转移潜能的增加表达大致呈下降趋势.作为Slit2受体的Robo1基因在10株肝癌细胞株中均发生甲基化修饰,但除在SMMC-7721、BEL-7402、L02不表达外,其余7种细胞株均有表达.Robo3基因相关CpG岛在9种肝癌细胞株中均未发生甲基化,同时其在mRNA水平均无表达. 结论 Slit/Robo可能在肝癌发生和发展中发挥作用.而Robo3则在肝癌中不发生表达而且其表达沉默可能不受甲基化方式调控.     

负载肝癌细胞裂解物的树突状细胞Transgelin表达水平与其功能的关系

目的 探讨负载肝癌细胞裂解物的树突状细胞(DC)Transgelin表达与其表型和功能的关系.方法 正常人来源的DC分成3组,分别为负载高转移潜能肝癌细胞MHCC97H、低转移潜能肝癌细胞MHCC97L的裂解物组和无负载DC(对照)组.用共聚焦显微镜和扫描电子显微镜观察DC形态;流式细胞仪检测DC表型,混合淋巴细胞反应及其上清液中白细胞介素(IL)-12含量测定以反映DC功能;Western blot测定DC中Transgelin的表达.结果 3组DC的形态未有明显不同,负载低转移潜能肝细胞癌组DC的CD80、CD83、CD86、混合淋巴细胞反应和IL-12含量明显高于对照组(P<0.01);负载高转移潜能肝细胞癌组DC的CD80、CD86、Transgelin表达明显高于对照组(P<0.05);负载高转移潜能肝细胞癌组DC的CD80、CD83、CD86和IL-12含量明显低于低转移组(P<0.05),而Transgelin表达则高于低转移组.结论 负载肝细胞癌裂解物的DC中Transgelin表达与其表型和功能有关.     

食管癌组织中CD44v6基因转录表达意义

目的探讨CD44v6 mRNA及其蛋白表达与食管癌病理生物学行为的关系,为观测食管癌侵袭转移潜能和评估胃癌患者预后寻求一个新的客观生物学指标.方法应用CSA法原位杂交和免疫组化技术,检测65例食管癌组织中CD44v6 mRNA及其蛋白表达,并结合肿瘤的病理生物学行为和临床随访资料分析.结果在食管癌中CD44v6 mRNA和其蛋白表达阳性率分别为61.5%(40/65)和58.5%(38/65),其表达均与食管癌浸润,淋巴结转移和预后密切相关(P＜0.05).结论检测CD44v6表达可作为预测食管癌转移潜能和评估患者预后的一个新的生物学指标.     

不同转移潜能肝癌细胞株血管内皮生长因子及其受体的表达和意义

目的 探讨血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1)在不同转移潜能肝癌细胞株中的表达及其意义.方法 应用半定量RT-PCR、酶联免疫吸附试验和(或)Western blot检测4株不同转移潜能的肝癌细胞株及一株正常肝细胞中VEGFR-1、VEGF-A、VEGF-B及VEGFR-2的mRNA和(或)蛋白质表达.结果 MHCC97-H、MHCC97-L和SMMC-7721细胞均有VEGFR-1 mRNA和蛋白质表达,且VEGFR-1 mRNA和蛋白质在MHCC97-H中的表达高于MHCC97-L、SMMC-7721的表达,两者比较,差异有统计学意义(P＜0.05),而其配体VEG-A和VEGF-B在检测的4种肝癌细胞株和正常肝细胞株L-02中均有表达.同时在检测的四种肝癌细胞株和正常肝细胞株L-02中均能检测到VEGFR-2 mRNA和蛋白质表达,但各组间表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 具有转移潜能的肝癌细胞株有VEGFR-1表达,而且其表达强弱与肝癌细胞株的转移潜能呈正相关,VEGFR-1的表达可能促进了肝细胞癌的侵袭转移.     

肝癌MHCC97H细胞中CD133~+和CD133~-亚群分选及其生物学特性

目的分选肝癌MHCC97H细胞中的CD133+和CD133-细胞亚群,并初步探讨CD133+细胞亚群的干细胞特性。方法用磁珠分选技术分选MHCC97H细胞株中的CD133+和CD133-细胞亚群,用流式细胞仪检测分选前后CD133的表达,用MTT法检测其增殖能力,比较其体内成瘤能力,用Western印迹法检测其干细胞相关基因蛋白的表达。结果分选前后MHCC97H细胞中CD133表达分别为(1.09±0.43)vs(86.65±6.49)%(P<0.01)。与CD133-亚群相比,CD133+亚群的体外增殖能力较强,成瘤能力高,高表达干细胞相关基因蛋白(P<0.05,P<0.01)。结论肝癌细胞株MHCC97H中的CD133+细胞亚群具有肿瘤干细胞的特性;CD133是人肝癌MHCC97H细胞株的肿瘤干细胞的表型之一。     

非小细胞肺癌组织中CD44s、CD44v6、Fas的表达及意义

目的 探讨非小细胞肺癌组织中CD44s、CD44v6、Fas的表达及临床意义.方法 采用SP免疫组化法检测CD44s、CD44v6及Fas基因蛋白在58例非小细胞肺癌、18例癌旁正常组织中的表达变化,分析其表达与肿瘤TNM分期、分化程度及淋巴结转移关系.结果 Fas基因蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达低于癌旁肺组织,CD44s和CD44v6在癌旁正常肺组织未见表达;CD44s在鳞癌和腺癌中的表达阳性率分别为83.3％及45.5％,CD44v6,在鳞癌和腺癌的表达阳性率分别为86.1％及40.9％,CD44s、CD44v6在鳞癌中的表达均高于腺癌（P均＜0.05）.Fas、CD44s和CD44v6的表达均与肿瘤TNM分期、分化程度及淋巴结转移相关.结论 非小细胞肺癌通过CD44分子的构型改变,降低Fas表达,逃逸Fas-FasL介导的细胞凋亡.非小细胞肺癌CD44s、CD44v6及Fas蛋白的检测可能为评价肿瘤预后的重要指标,也为非小细胞肺癌的治疗提供新的靶点.     

DLC-1基因表达与肝细胞癌复发转移的关系

目的已报道人类染色体8p缺失可能与肝癌转移有关,本文应用实时定量聚合酶链反应(RQ- PCR)研究位于8p的DLC-1基因mRNA表达与肝细胞癌侵袭转移的关系。方法收集51例复旦大学中山医院外科手术切除的肝细胞癌(HCC)及癌旁正常组织标本,根据临床病理学指标,分为高低侵袭性两组,用RQ-PCR对不同侵袭性HCC之间的DLC-1基因表达进行分析。对不同侵袭转移潜能MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM3、Hep3B及HepG2肝癌细胞系用同样方法分析DLC-1基因的表达差异。结果非转移细胞系Hep3B和HepG2与转移细胞系MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM3之间DLC—1基因表达差异有统计学意义(P相似文献   

c-Met represents a potential therapeutic target for personalized treatment in hepatocellular carcinoma

c-Met, a high-affinity receptor for hepatocyte growth factor (HGF), plays a critical role in cancer growth, invasion, and metastasis. Hepatocellular carcinoma (HCC) patients with an active HGF/c-Met signaling pathway have a significantly worse prognosis. Although targeting the HGF/c-Met pathway has been proposed for the treatment of multiple cancers, the effect of c-Met inhibition in HCC remains unclear. The human HCC cell lines Huh7, Hep3B, MHCC97-L, and MHCC97-H were used in this study to investigate the effect of c-Met inhibition using the small molecule selective c-Met tyrosine kinase inhibitor PHA665752. MHCC97-L and MHCC97-H cells demonstrate a mesenchymal phenotype with decreased expression of E-cadherin and increased expression of c-Met, fibronectin, and Zeb2 compared with Huh7 and Hep3B cells, which have an epithelial phenotype. PHA665752 treatment blocked phosphorylation of c-Met and downstream phosphoinositide 3-kinase/Akt and mitogen-activated protein kinase/Erk pathways, inhibited cell proliferation, and induced apoptosis in c-Met-positive MHCC97-L and MHCC97-H cells. In xenograft models, administration of PHA665752 significantly inhibited c-Met-positive MHCC97-L and MHCC97-H tumor growth, and PHA665752-treated tumors demonstrated marked reduction of both c-Met phosphorylation and cell proliferation. c-Met-negative Huh7 and Hep3B cells were not affected by c-Met inhibitor treatment in vitro or in vivo. In addition, c-Met-positive MHCC97-L and MHCC97-H cells demonstrated cancer stem cell-like characteristics, such as resistance to chemotherapy, tumor sphere formation, and increased expression of CD44 and ABCG2, and PHA665752 treatment suppressed tumor sphere formation and inhibited CD44 expression. Conclusion: c-Met represents a potential target of personalized treatment for HCC with an active HGF/c-Met pathway.     

Differential proteomic analysis of human hepatocellular carcinoma cell line metastasis-associated proteins

PURPOSE: The comparative study of differentially expression of protein profiles of hepatocellular carcinoma cell lines with various metastasic potential and screening key molecules related to hepatocellular carcinoma metastasis and recurrence. METHODS: Using two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS), we analyzed differentially displayed proteomics of human hepatocellular carcinoma cell lines Hep3B, MHCC97L, MHCC97H with different metastasic potential. RESULTS: Approximate 1,000 protein spots were detected on silver-stained gel by ImageMaster (977+/-113 spots in Hep3B, 1092+/-40 in MHCC97L, and 889+/-14 in MHCC97H). Fifty distinct different protein spots were analyzed with online LC-ESI-MS/MS. Only 26 protein spots had a positive result, including annexin1, S100A4, and so on. In comparison with nonmetastasis Hep3B cell lines, there were 16 proteins overexpressed in MHCC97H and MHCC97L, 10 proteins underexpressed in MHCC97H and MHCC97L. Applying cell immunohistochemistry and RT-PCR, we further validated two interesting and different proteins, annexin1 and S100A4. CONCLUSION: The protein profile of metastatic hepatocellular carcinoma cell lines displayed obvious differences compared with non-metastatic liver cancer cell lines. The results imply that various different proteins may lead to HCC metastasis together.     

不同转移潜能人肝癌细胞系转录因子活性差异分析

目的分析不同转移潜能人肝癌细胞系细胞核内转录因子活性的差异，筛选与肝癌转移相关的转录因子。方法应用转录因子活性芯片技术，在功能水平分析三种不同转移潜能人肝癌细胞系（Hep3B、MHCC97L和MHCC97H）细胞核内转录因子活性的差异，并用电泳迁移率变动分析和蛋白免疫印迹实验验证芯片结果。结果在345个候选的转录因子中，筛选出7个活性差异转录因子。随人肝癌细胞转移潜能的增高（Hep3B〈MHCC97L〈MHCC97H），活性上调的转录因子有5个，包括p53、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、核因子κb、信号传导及转录活化因子3（Stat3）和Sp1；活性下调的转录因子有2个，包括Rb和Smad3。结论转录因子活性异常与肝癌转移密切相关，本实验筛选出的转录因子可能有助于揭示肝癌转移的分子机制，并寻找新的预测指标及干预治疗的靶点。     

不同转移潜能人肝癌细胞株趋化因子受体谱差异表达

目的对比观察不同转移潜能人肝癌细胞株趋化因子受体谱差异性表达。方法Pre- mier软件设计18对趋化因子受体引物,RT-PCR分析SMMC-7721、MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM6细胞侵袭转移潜能逐渐增强的人肝癌细胞株趋化因子受体谱。结果4组不同转移潜能细胞株趋化因子受体表达谱存在明显差异（P＜0．01）,其中CCR10、CXCR4、CXCR6表达随转移潜能增加逐渐降低。HCCLM6表达谱中CCR3、CCR4、CCR10、CCR12及XCR1比SMMC-7721表达明显降低甚至缺失（P＜0．01）,而CXCR1（P=0．006）、CXCR5（P=0．003）表达高于低转移潜能组SMMC-7721。MHCC97-H和MHCC97-L比较,除CXCR2、CXCR6、XCR1外差异均有统计学意义,其中CCR1（P=0．002）、CCR2（P=0．004）、CCR5（P=0．046）表达高于MHCC97- L。CXCR4在模板减量时只能在SMMC-7721组检测到。结论高低转移潜能肝癌细胞株趋化因子受体表达在mRNA水平存在差异性表达,与肝癌细胞株差异性转移潜能相关。