CD自杀基因联合淋巴细胞趋化因子基因疗法的肿瘤治疗作用及免疫机理研究

本研究以腺病毒作为载体,将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因与小鼠淋巴细胞趋化因子(Ltn)基因体内联合转染,观察了其抗肿瘤效应并分析了免疫机理.小鼠皮下接种结肠腺癌CT26细胞后3天,肿瘤局部注射表达Ltn的重组腺病毒AdLtn和表达CD的重组腺病毒AdCD,然后连续10天给予5一氟胞嘧啶(5-FC)300mg/kg进行治疗,结果表明,联合治疗组荷瘤小鼠皮下肿瘤结节的生长受到明显抑制,小鼠存活期明显长于单用AdLtn治疗组或单用AdCD/5-FC治疗组.经联合治疗后小鼠脾细胞的NK活性和对(37结肠腺癌细胞的CTL杀伤活性明显增强.瘤体细胞FACS分析结果表明,经联合基因治疗后,肿瘤组织CD4~ 、CD8~ 细胞浸润增加,结肠腺癌细胞表达H-2Kd和B7-1分子明显增加.提示经CD自杀基因和Ltn基因联合治疗后,肿瘤细胞免疫原性增加.本研究结果表明联合应用自杀基因和Ltn基因治疗可以提高机体对肿瘤细胞免疫的应答,增加机体的抗肿瘤作用,是肿瘤基因治疗中一条新的途径.     

T细胞及相关免疫分子在淋巴细胞趋化因子增强肿瘤自杀 …

本室以往的研究表明，用腺病毒作为载体将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因与小鼠淋巴细胞趋化因子（Ｌｉｎ）基因联合体内转染，具有显著的抗肿瘤效应。本文对其免疫机理进行了进一步研究，发现ＣＴ２６结肠腺癌细胞体外经过ＣＤ／Ｌｉｎ基因转染并给予前体药物５－ＦＣ后，ＣＴ２６结肠腺癌细胞表达ＣＤ８０和ＣＤ５４分子明显增加，提示经ＣＤ自杀基因和Ｌｉｎ基因联转移后，肿瘤细胞免疫原性增加。荷瘤小鼠体内经联合治疗后，小     

腺病毒介导CD/5FC“自杀基因”疗法对人肝癌裸鼠和小鼠结肠腺癌的治疗作用研究

“自杀基因”疗法应用于肿瘤治疗时,通常是在肿瘤局部直接转染“自杀基因”,以期达到在肿瘤局部发挥抗肿瘤作用而避免全身毒性.在本实验中,我们观察了腺病毒介导的“自杀基因”疗法(CD/5FC系统)对人肝细胞癌SMMC-7721及小鼠结肠腺癌CT26的生长抑制作用,证实了腺病毒介导的CD/5FC系统在体外能杀伤人肝癌细胞SMMC-7721,并且能明显地抑制裸鼠SMMC-7721肿瘤模型的生长,对小鼠的结肠腺癌CT26也有一定的治疗作用.同时观察了以AFP启动子驱动的CD基因合并5FC的使用对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤作用,证实了以肝癌特异启动子驱动的CD基因能在高表达AFP的肝癌细胞HepG2中特异表达,合并5FC的使用能在体外特异地杀伤HepG2细胞.这一组织特异性的“自杀基因”系统能特异地抑制高水平分泌AFP的人肝细胞癌裸鼠模型7721AFP( )的生长,上述研究结果表明,腺病毒介导的CD/5FC系统是一个有效的治疗方案,组织特异性的表达调控更能体现该疗法的实用价值.     

腺病毒介导的CD/5FC自杀基因疗法对小鼠结肠腺癌的治疗作用及相关免疫机理的研究

大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶CD可以将前体药物5FC代谢为毒性产物5FU,具有抗肿瘤作用.本课题我们观察了腺病毒介导的CD/5FC自杀基因疗法对小鼠结肠癌生长的治疗作用并探讨其作用机理.结果表明,首先,CD/5FC自杀基因疗法小鼠结肠癌CT26体内外生长均具有显著的抑制作用,4O%的荷瘤小鼠经过治疗后长期存活;其次,我们还研究了自杀基因疗法治疗肿瘤时可能涉及的免疫机理.结果发现在以CD/5FC系统治疗结肠腺癌小鼠过程中能在一定程度上诱导出机体的抗肿瘤免疫反应,包括脾脏CT6L活性的增高、肿瘤局部浸润免疫细胞表达,DEC-205、B7-2、I-A~(b,d)分子增加等.本实验结果提示虽然CD/5FC系统可以诱导机体产生一定的抗肿瘤免疫反应,但其程度不够显著.     

MIP-1β基因修饰增强肿瘤相关抗原致敏树突状细胞的抗肿瘤免疫效果

目的:探讨通过增强树突状细胞(dendritic cells,DC)与T细胞的相互作用来进一步增强DC介导的抗肿瘤免疫效果.方法:体外培养的小鼠骨髓DC体外经携带人MIP-1β基因的重组腺病毒(adenovirus expressing human macrophoge inflammatory protein-1 beta,AdhMIP-1β)转染后(MIP-1β-DC),用小鼠CT26结肠腺癌细胞相关抗原冲击致敏,然后免疫正常同系小鼠,观察其体内诱导的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)的保护性免疫反应;通过体内阻断试验探讨免疫细胞亚群及免疫分子在DC诱导抗肿瘤免疫应答中的作用.结果:经抗原致敏的MIP-1β-DC能更有效地诱导特异CTL活性,能使免疫动物产生更有效的免疫保护作用,抵抗肿瘤细胞的攻击.通过对其抗肿瘤免疫机理的分析发现,CD4 、CD8 T细胞共同参与了经抗原致敏的MIP-1β-DC介导的抗肿瘤免疫反应,是主要的抗瘤效应细胞,NK细胞作用不明显.结论:通过基因修饰增强树突状细胞对T细胞的体内趋化活性,能更有效地诱导抗肿瘤免疫反应,为树突状细胞介导的肿瘤免疫基因治疗开辟了新的途径.     

人巨噬细胞炎性蛋白-1β基因修饰肿瘤细胞的体内致瘤性和瘤苗效果

目的 探讨人巨噬细胞炎性蛋白-1β(hMIP-1β)基因修饰小鼠结肠腺癌CT26细胞的致瘤性和瘤苗免疫效果.方法 通过重组腺病毒载体介导,将hMIP-1β基因导入CT26细胞中,X-gal染色法检测基因转染效率;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测hMIP-1β基因修饰CT26细胞培养上清中hMIP-1β的含量;采用Boyden趋化小室法检测培养上清对CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞和未成熟树突状细胞(imDC)的趋化作用.BALB/c小鼠皮下接种hMIP-1β基因修饰的CT26细胞,观察其体内致瘤性的改变和对免疫细胞的趋化作用;制备hMIP-1β基因修饰的CT26细胞瘤苗并免疫BALB/c小鼠,观察其诱导免疫细胞的杀伤活性和保护性免疫反应.结果 腺病毒载体可介导hMIP-1β基因转染CT26细胞和表达,X-gal染色的阳性率可达95.0%以上.在培养上清中hMIP-1β水平为980 pg/ml细胞,并对CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞和imDC有显著的趋化作用,与转染对照基因LacZ的CT26细胞及野生型CT26细胞比较,差异有统计学意义(P＜0.01).体内致瘤实验显示,hMIP-1β基因修饰的CT26细胞皮下接种后,成瘤率降低,肿瘤生长速度减慢,肿瘤内可见明显坏死灶,坏死灶内和周围可见较多淋巴细胞浸润.hMIP-1β基因修饰的CT26细胞瘤苗免疫小鼠能有效诱导肿瘤特异性CTL活性和非特异性NK活性,产生明显的免疫保护作用,可抵抗肿瘤细胞的再攻击.结论 hMIP-1β基因修饰的CT26细胞致瘤性显著下降,其瘤苗可诱导强烈的抗肿瘤免疫反应,提示hMIP-1β基因修饰瘤苗有望成为更有效的抗肿瘤免疫治疗手段.     

IL-2基因与自杀基因联合转移对小鼠红白血病的治疗作用

用腺病毒作为载体,将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因体外转染小鼠红白血病FBL-3细胞,结果CD基因转移后该细胞对5-氟胞嘧啶(5-FC)的敏感性提高了近1000倍,FBL-3细胞有明显的凋亡发生,且观察到明显的旁观者效应.小鼠体内接种FBL-3红白血病细胞后3天,肿瘤局部注射小鼠白细胞介素2(IL-2)基因的表达载体(Ad-IL-2)和Ad-CD腺病毒载体,然后连续10天给予5-FC 300mg/kg行治疗.结果FBL-3皮下肿瘤的生长明显受到抑制,部分小鼠肿瘤消失.联合治疗小鼠的存活期明显大于单用Ad-IL-2治疗组和单用自杀基因CD与5-FC治疗组.体内免疫功能检测表明,经小鼠自杀基因与IL-2联合基因治疗后小鼠脾细胞的CTL杀伤     

过继回输腺病毒介导的白细胞介素10基因转染CTL对机体抗肿瘤免疫功能的增强效应

本研究探讨了白细胞介紊10(IL-10)对小鼠体内抗肿瘤免疫功能的影响。鉴于C26结肠癌细胞转染了IL-10基因后在体内的致瘤性明显下降，本研究构建了一株对C26结肠癌细胞具有杀伤括性的CD8^ CTL并观察了IL-10基因转染的该细胞株对肿瘤的治疗作用。携带IL-10基因的重组腺病毒能有效介导小鼠琳巴细胞的基因转染并使之分泌较高水平的IL-10。IL-10基因转染的CTL过继回输荷瘤小鼠体内能明显增强荷瘤小鼠的体内抗肿瘤免疫功能，使实验性肺转移小鼠肺部转移结节数明显减少．这表明，IL-10对于过继回输的肿瘤特异性CTL的免疫功能具有明显的增强作用。     

MIP-1β基因修饰增强肿瘤相关抗原致敏树突状细胞的抗肿瘤免疫效果

目的：探讨通过增强树突状细胞(dendritic cells, DC)与T细胞的相互作用来进一步增强DC介导的抗肿瘤免疫效果。方法：体外培养的小鼠骨髓DC体外经携带人MIP1β基因的重组腺病毒(adenovirus expressing human macrophoge inflammatory protein1 beta, AdhMIP1β)转染后(MIP1βDC)，用小鼠CT26结肠腺癌细胞相关抗原冲击致敏，然后免疫正常同系小鼠，观察其体内诱导的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)的保护性免疫反应；通过体内阻断试验探讨免疫细胞亚群及免疫分子在DC诱导抗肿瘤免疫应答中的作用。结果：经抗原致敏的MIP1βDC能更有效地诱导特异CTL活性，能使免疫动物产生更有效的免疫保护作用，抵抗肿瘤细胞的攻击。通过对其抗肿瘤免疫机理的分析发现，CD4+、CD8+ T 细胞共同参与了经抗原致敏的MIP1βDC介导的抗肿瘤免疫反应，是主要的抗瘤效应细胞，NK细胞作用不明显。结论：通过基因修饰增强树突状细胞对T细胞的体内趋化活性，能更有效地诱导抗肿瘤免疫反应，为树突状细胞介导的肿瘤免疫基因治疗开辟了新的途径。     

腺病毒介导IL-2基因转染的瘤苗体内抗肿瘤作用

目的 :探讨重组腺病毒介导的 IL- 2基因转染的瘤苗的体内抗肿瘤作用及其免疫学机制。方法 :应用腺病毒介导的鼠 IL- 2基因转染 CT2 6小鼠结肠癌细胞 ,灭活后用作瘤苗治疗荷瘤小鼠 ,观察皮下肿瘤生长及其存活期。采用乳酸脱氢酶释放法检测荷瘤小鼠脾细胞 CTL、L AK、NK细胞的杀伤活性。结果 :鼠 IL- 2基因转染瘤苗治疗能显著抑制荷瘤小鼠皮下肿瘤生长并明显延长其存活期 (P<0 .0 1)。体内免疫功能检测表明 ,鼠 IL- 2基因转染疫苗治疗组小鼠脾细胞 CTL 活性、L AK活性和 NK活性显著高于对照组 (P<0 .0 1)。结论 :腺病毒介导鼠 IL- 2基因转染的瘤苗体内具有较强的抗肿瘤效应 ,其机制可能是提高了荷瘤小鼠特异性和非特异性抗肿瘤免疫反应     

多种肿瘤抑制基因在视网膜母细胞瘤中存在状态的研究

目的 深入研究视网膜母细胞瘤（ＲＢ）内多种肿瘤抑制基因的存在状态。方法 综合利用ＳＳＣＰ分析、ＤＮＡ序列测定以及多重ＰＣＲ等技术,检测分析ＲＢ肿瘤内Ｒｂ、ｐ５３,ｐ１６,ｐ１５及ｐ１２等肿瘤抑制基因是存在缺失与点突变。结果 约７４％的ＲＢ肿瘤有Ｒｂ基因点突变,１６％显示,ｐ１６基因缺失,但ｐ５３及ｐ２１基因除多态性外未检测到真正的点突变。结论 ＲＢ的发病和病变的进展主要是由于以Ｒｂ基因为核心的代谢     

亚硒酸钠抗氧化作用与抑瘤效应的实验观察

人ｐ１６基因是最近发现的一种肿瘤抑制基因。ｐ１６蛋白作为一种细胞增殖的负调控因子，在恶性肿瘤发生发展中起重要作用。为了进一步探讨ｐ１６基因的抗肿瘤特性，我们通过运用分子克隆技术构建重组人ｐ１６基因表达载体（ｐｃＤＮＡ３－ｐ１６），并通过电穿孔方法将ｐ１６基因导入到人肺腺癌ＮＣＩ－Ｈ４６０细胞中，经Ｃ４１８筛选获得可稳定表达ｐ１６的人肺腺癌细胞，观察ｐ１６基因对人肺腺癌细胞周期的影响和细胞增殖的作用     

探讨HBV X、TGF-alpha,c-myc及beta-catenin基因与高发区肝癌的相关性

目的　研究HBVX基因、TGF alhpa、c myc、beta catenin等癌变相关基因及 2 49密码子突变的p5 3蛋白在高发区肝细胞癌癌变发生及其恶性表型维持所发挥的作用。方法　以肝癌高发区启东的肝癌细胞株 770 1和 770 3标本作为研究对象 ,以PCR及DNA测序分析方法确定HBVX基因在细胞DNA水平的整合。以RT PCR及Western blot检测HBVX基因的转录与表达。用PCR RFLP方法确定 p5 3基因 2 49密码子的错义突变。应用免疫组织化学法分析TGF alhpa ,c myc ,beta catenin的表达。结果　 2株细胞在DNA水平都存在HBVX基因片断的整合 ,但未见完整的转录和蛋白水平表达。序列分析显示 2株细胞的HBVX基因的序列各有特异性 ,并存在 13 0、13 1密码子的热点突变。PCR RFLP分析说明 2个细胞株中p5 3基因 2 49密码子均属野生型。免疫组化显示 2株细胞中TGF alpha ,c myc和beta catenin蛋白均有显著的积累。 结论　本实验的结果显示HBVX基因对这 2株细胞恶性表型的维持并不存在必然的关联 ,而是 1种HBV感染的遗传标志。未见HBVX基因蛋白表达 ,可能由于X基因 3′端缺失变异所致。免疫组化的结果显示TGF alpha ,c myc和beta catenin蛋白的显著积累 ,说明多种癌基因的相互协同 ,可能与肝癌的发生、发展及恶性表型的维持相关联     

人乙肝病毒基因在家蝇基因组中的整合

背景与目的:探讨人乙肝病毒基因能否整合在家蝇基因组中.材料与方法:构建人乙肝病毒基因质粒载体pHBVneo,以电转移方式在新生家蝇蝇卵中实施HBV基因转移,通过特异PCR反应鉴定HBV基因在转人乙肝病毒基因家蝇基因组中的整合情况.结果:成功构建了人乙肝病毒基因质粒载体pHBVneo,并在转HBV基因家蝇基因组中检测到特异HBV基因存在.结论:人乙肝病毒基因能够在家蝇基因组中整合.     

RFP标记的 YCD 基因在 HeLa 细胞中的表达及其介导的细胞毒性

背景与目的 :探讨红色荧光蛋白标记的酿酒酵母菌胞嘧啶脱氨酶(YCD)基因在人宫颈癌细胞(HeLa细胞)中的表达及其功能。材料与方法 :采用基因重组技术构建含有CMV启动子和RFP、YCD基因开放阅读框(ORF)的真核表达载体pIRES_YCD ,脂质体法转染HeLa细胞。荧光显微镜下观察转染细胞中红色荧光蛋白的表达 ,流式细胞术分析转染效率及荧光强度并筛选荧光阳性细胞 ,命名为HeLa_Y。以不同浓度的前药5_FC处理HeLa_Y细胞 ,MTT法检测细胞存活率。 结果 :荧光显微镜下可见红色荧光蛋白在HeLa_Y细胞中表达 ,流式细胞术成功筛选出HeLa_Y细胞。前药5_FC能明显杀伤HeLa_Y细胞 ,5_FC浓度与HeLa_Y之间存在对数曲线关系。结论 :RFP可作为报告基因快速筛选YCD表达载体转染的细胞 ,YCD/5_FC自杀基因系统可以进一步用于肿瘤的基因治疗研究     

RI基因真核表达载体的构建及其对C6胶质瘤细胞生长的影响

目的通过构建核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor, RI)基因的真核表达载体——pLNCX-ri, 并转染C6神经胶质瘤细胞,探讨RI抑制肿瘤生长的作用机制.方法用Nde I / Xho从已构建的pET-ri上切下1.4 kb的RI基因片段,再构建到pLNCX上,获得真核表达载体(pLNCX-ri),采用Lipofect AMINE辅助转染大鼠C6神经胶质瘤细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,用Western blotting 检测RI基因的表达水平.将转染阳性的C6神经胶质瘤细胞接种于大鼠皮下,观察肿瘤的生长情况.结果在转染的C6神经胶质瘤细胞中,RI基因的表达量明显高于未转染的C6神经胶质瘤细胞,转染阳性的C6神经胶质瘤细胞在大鼠体内的成瘤潜伏期23±5.7天(对照组14±3.5天),瘤组织重量转染组1.35±0.43g比对照组2.40±0.61g(P＜0.01)明显下降,瘤组织的血管密度转染组27.2±4.31比对照组47±6.54(P＜0.01)明显减少.结论RI基因的转染对肿瘤的生长有明显抑制作用,其作用机制可能是抑制肿瘤组织血管的形成.     

人白细胞介素2重组逆转录病毒载体的构建与表达

通过RT-PCR克隆到含有全部编码序列的人IL-2 cDNA,并经核苷酸测序加以证实。将其克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建成人IL-2的重组逆转录病毒表达载体pLXSN-hIL2,体外经CRIP细胞包装后病毒滴度达7.6×10~5CFU/ml。NIH3T3小鼠成纤维细胞感染hIL-2重组逆转录病毒后,分泌IL-2水平达118.2U/ml;PCR从其基因组DNA中扩增到NeoR基因片段,提示重组逆转录病毒载体己整合至宿主细胞的基因组DNA中。本研究为开展人IL-2基因治疗奠定了基础。     

Stathmin 基因在非小细胞肺癌中的表达

目的：检测 Stathmin 基因在非小细胞肺癌组织中的表达,探讨其与临床病理因素的关系。方法：用免疫组织化学 SP 法检测135例非小细胞肺癌及20例癌旁肺组织中 Stathmin 蛋白的表达,分析其与患者年龄、性别、肿瘤分化程度等临床病理特征之间的相关性。结果：小细胞肺癌组织中 Stathmin 基因蛋白的表达水平明显高于癌旁肺组织（P ＜0．05）,Stathmin 的表达与淋巴结转移有关（P ＜0．05）。结论：Stathmin 基因在非小细胞肺癌组织中的表达显著上调;Stathmin 基因的表达与淋巴结转移有关,而与年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期、组织类型无关。     

RON、Hepsin和C-Met在浸润性乳腺癌中的表达及其意义

目的探讨浸润性乳腺癌组织中RON和Hepsin、C—Met的免疫表达及其意义。方法采用免疫组化PV-6000法检测了87例浸润性乳腺癌组织中RON和Hepsin、C—Met基因的表达情况。结果Hepsin、C—Met、RON在87例浸润性乳腺癌组织中的阳性表达率分别为70．1％、64．4％、65．5％,三者的阳性表达两两呈正相关（P〈0．01）,同时与浸润性乳腺癌的病理学分级、淋巴结转移亦呈正相关性（P〈0．01）。结论Hepsin、C-Met、RON与浸润性乳腺癌的预后因素有相关性,联合检测可以更好地提示患者的预后。     

肺癌患者GSTM1基因型与p53基因突变的相关关系研究

目的:探索肺癌患者Ⅱ相代谢酶主要亚型GSTM1的基因型与p53基因突变的关系.方法:应用双重PCR和PCR-SSCP(单链构像多态性分析)技术,检测了63例肺癌患者和47例健康对照中GSTM1基因缺失及肺癌组织p53基因突变的情况,并分析其相关关系.结果:肺癌组GSTM1基因缺失率为71.4%(45/63),对照组为51.1%(24/47),差异有显著统计学意义,OR为2.40(95%CI为1.09-5.29).p53基因突变率在63例肺癌组织中为49.2%(31/63),在15例对照组织中仅为6.6%(1/18).58.1%肺癌病例同时存在p53基因突变和缺失GSTM1基因(P＜0.05).结论:GSTM1基因缺失与p53基因突变相关,GSTM1基因缺失可能增加p53基因突变的几率,从而导致肺癌患病危险性的增加.