靶向VEGF发夹状RNA对宫颈癌HeLa细胞抑制作用的研究

目的:运用RNAi技术下调血管内皮生长因子(VEGF)在HeLa细胞中的表达,观察其对肿瘤细胞凋亡的影响,为人宫颈癌治疗提供理论依据。方法:设计并构建针对VEGF的携带绿色荧光蛋白(GFP)发夹状RNA(shRNA)质粒表达载体(PGPU6/GFP/Neo-shRNA),脂质体法转染HeLa细胞;荧光显微镜观察GFP的表达,并计算转染效率;RT-PCR检测HeLa细胞VEGF的表达,筛选出靶序列;再用流式细胞仪法检测细胞凋亡。结果:构建的PGPU6/GFP/Neo载体成功转入HeLa细胞;转染48h后,HeLa-shVEGF1组HeLa细胞VEGFmRNA表达的抑制率为75.0%;与HeLa组和HeLa-shNC组相比,HeLa-shVEGF1组HeLa细胞凋亡率明显增加,P<0.01。结论:本研究构建的PGPU6-shRNA表达载体携带GFP便于观察细胞的转染情况,且不影响U6启动子的转录,同时有效沉默了VEGF基因,明显增加HeLa细胞的凋亡,为未来肿瘤的治疗提供新途径。     

CXCL16基因与红色荧光蛋白pDsRed2-N1融合基因表达载体的构建

目的:构建人趋化因子配体16(CXC ligand 16,CXCL16)与增强型红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的融合基因表达载体pDsRed2-N1/CXCL16,使CXCL16-RFP融合蛋白在人293T细胞中稳定表达。方法:针对CXCL16基因设计引物,扩增人CXCL16 cDNA,退火后插入含有RFP的表达载体pDsRed2-N1。测序正确的CXCL16和RFP的融合基因表达载体pDsRed2-N1/CXCL16,经脂质体转染人293T细胞株,G418筛选获得稳定转染的细胞株。荧光显微镜观察细胞转染情况,Western blotting比较转染前后293T细胞中CXCL16蛋白的表达变化。结果:经转化细菌、抽提质粒、酶切鉴定和DNA序列分析证实,CXCL16基因已正确插入pDsRed2-N1中RFP基因的上游,获得融合基因表达载体pDsRed2-N1/CXCL16。空载体pDsRed2-N1和融合基因表达载体pDsRed2-N1/CXCL16经脂质体转染人293T细胞后,在荧光显微镜下可观察到表达RFP的细胞发出红色荧光,转染效率分别可达95%和85%。pDsRed2-N1/CXCL16转染293T细胞后,CXCL16蛋白的表达水平显著上调。结论:成功构建的pDsRed2-N1/CXCL16融合基因表达载体可在293T细胞中稳定表达CXCL16蛋白,为进一步研究CXCL16在细胞增殖调控中的作用奠定了基础。     

慢病毒载体介导的自杀基因系统YCD/5-FC对人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞杀伤效应的研究

背景与目的:酵母菌胞嘧啶脱氨酶(yeast cytosine deaminase,YCD)可将无毒性的抗真菌药5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)转化为细胞毒性产物氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU),进而阻抑DNA、RNA和蛋白质合成,引起细胞死亡.本研究中构建含YCD基因的慢病毒载体质粒,体内外观察YCD/5-FC自杀基因系统的杀伤效应.方法:应用亚克隆技术将YCD和绿色荧光蛋白基因(green fluorescence protein,GFP)连接至慢病毒空载体pFUW,构建获得pGC-FU-YCD-GFP.将3质粒系统(含包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒)脂质体法共转染包装细胞293T,获得的慢病毒转染人Jurkat细胞,流式细胞仪(FACS)和Western blot检测Jurkat/YCD-GFP表达水平;加入前体药物5-FC,观察对靶细胞的杀伤情况和旁观者效应.转基因细胞接种至裸鼠前肢皮下,观察体内肿瘤杀伤情况.结果:慢病毒载体3质粒系统感染293T细胞后,获得的慢病毒滴度为1.2×108TU/mL.该病毒可高效转染人Jurkat细胞,感染率达96.93%,Western blot显示转基因细胞可分泌YCD蛋白.100 μmol/L 5-FC作用96 h可杀伤(89.37±6.57)%的Jurkat/YCD-GFP细胞.混合培养提示存在明显的旁观者效应.转基因细胞可在小鼠体内致瘤,5-FC可明显抑制肿瘤生长.结论:成功构建慢病毒载体pGC-FU-YCD-GFP,YCD/5-FC自杀基凶系统在体内外均有显著的特异性杀伤效应.     

FHIT对急性髓系白血病细胞HL60影响的研究

目的:进行外源FHIT基因转染人白血病细胞缺乏FHIT表达的HL60,研究FHIT基因对转染细胞生长的生物学影响。方法:构建pEGFP-FHIT真核表达质粒(实验组)与质粒pEGFP-N1(对照组)。分别电穿孔法转染HL60细胞。应用荧光显微镜、RT-PCR、Westernblot检测转染基因的转录和表达情况。四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞术研究转染基因对HL60细胞体外增殖、凋亡情况的影响,并与转染对照质粒的细胞株进行比较。结果:经PCR、酶切和DNA测序证实pEGFP-FHIT真核载体构建成功。荧光显微镜下实验组HL60细胞可见绿色荧光,转染率为40%。RT-PCR和Westernblot分别从mRNA和蛋白水平检测到FHIT的表达。MTT检测结果显示:转染后实验组抑制率明显升高,细胞增殖受到抑制(P<0.05)。流式细胞术结果显示:实验组细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。结论:转染FHIT基因对白血病细胞HL60的生长有抑制作用,并能诱导其凋亡。     

靶向Survivin基因siRNA对HeLa细胞放射敏感性的影响

目的:探讨si RNA抑制Survivin表达对宫颈癌HeLa细胞γ射线敏感性的影响。方法:设计并合成si RNA,构建si R-NA真核表达载体的。将测序正确的pSU-PER/Survivin载体转染HeLa细胞,应用RT-PCR和流式细胞仪检测HeLa细胞中Survivin基因在mRNA和蛋白表达水平的改变。流式细胞仪检测各组HeLa细胞的凋亡率差异。结果:成功构建了pSUPER/Survivin载体。转染pSUPER/Survivin的HeLa细胞其Survivin基因表达水平明显低于未转染及转染空载体pSUPER的HeLa细胞。γ射线照射后,转染pSUPER/Sur-vivin的HeLa细胞凋亡细胞率显著高于其他两种细胞。应用χ2检验比较3种细胞的早期凋亡细胞率:转染pSUPER/Survivin与未转染(χ2=14.88,P=0.00);转染pSU-PER/Survivin与转染空载体pSUPER(χ2=13.10,P=0.00);未转染与转染空载体pSUPER(χ2=0.082,P=1.00)。结论:在HeLa细胞中抑制Survivin基因的表达能够提高其对γ射线的敏感性,增加细胞凋亡。     

人源FOXG1基因真核表达载体的构建、表达及其对HeLa细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的:构建人源FOXG1真核表达载体,瞬时转染HeLa细胞实现FOXG1过表达,观察FOXG1对HeLa细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,为后续研究人源FOXG1基因在肿瘤中的作用机制奠定理论基础。方法:利用One Step Cloning法构建重组质粒pEGFP-C1-FOXG1,并通过酶切、测序对重组质粒进行鉴定;采用脂质体介导的转染法将pEGFP-C1-FOXG1瞬时转染至HeLa细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测HeLa细胞中EGFP-FOXG1融合蛋白的表达;进一步,分别通过CCK8、伤口愈合和Transwell实验检测FOXG1对HeLa细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果:酶切鉴定和测序表明重组质粒pEGFP-C1-FOXG1构建成功;瞬时转染HeLa细胞24小时后,能够在荧光显微镜观察到绿色荧光,48小时后转染效率达到90%;Western blot显示EGFP-FOXG1融合蛋白正确表达;CCK8实验表明过表达FOXG1能够促进HeLa细胞的增殖;伤口愈合和Transwell实验表明FOXG1过表达可以促进HeLa细胞的迁移和侵袭。结论:成功构建了pEGFP-C1-FOXG1重组质粒,并在HeLa细胞中正确表达;功能实验表明FOXG1能够促进HeLa细胞增殖、迁移和侵袭。     

siRNA抑制survivin基因周期的影响表达对HeLa细胞

目的设计靶向survivin基因的干涉片段,构建真核表达载体pSUPER／survivin并转染宫颈癌HeLa细胞,探讨siRNA抑制survivin表达对联合1射线宫颈癌HeLa细胞周期的影响。方法化学合成干涉引物,退火获得survivin基因的干涉片段,连入pSUPER载体并测序。将测序正确的pSUPER／survivin载体转染HeLa细胞株,RT—PCR法和流式细胞术检测HeLa细胞中survivin基因的表达,流式细胞术检测转染联合＇射线照射后各组细胞的细胞周期数据。结果本实验成功的构建了pSUPER／survivin载体。转染pSUPER／survivin的HeLa细胞其survivin基因表达水平明显低于未转染的HeLa细胞及转染空载体pSUPER的HeLa细胞。1射线照射后,转染pSUPER／survivin的HeLa细胞发生了S期细胞比例下降,及G2／M期阻滞。结论成功的构建了pSUPER／survivin载体,siRNA干涉survivin可以作为提高放射敏感性的潜在分子靶点,通过减少S期细胞比例,促进肿瘤细胞凋亡,通过增加G2／M期阻滞增加放射线的杀伤。     

乙肝病毒X蛋白诱导HeLa细胞和转基因小鼠肝细胞凋亡的研究

背景与目的:探讨乙型肝炎病毒X蛋白在细胞凋亡中的作用.材料与方法:采用基因重组技术构建乙型肝炎病毒x基因的真核表达载体pcDNA3-HBx.脂质体FuGENE6转染HeLa细胞,并用蛋白印迹检测pcDNA3-HBx在HeLa细胞中的表达.流式细胞术检测细胞凋亡率.结果:成功构建了可在真核细胞中稳定表达X蛋白的HBx基因真核表达载体pcDNA3-HBx.稳定转染pcDNA3-HBxDNA的HeLa-Xs细胞的凋亡率为9.8%,较空白HeLa细胞的凋亡率(0.4%)以及对照细胞HeLa-Vs细胞的凋亡率(1.3%)高;两只转基因小鼠肝细胞的细胞凋亡率分别为54.4%和40.4%,较正常小鼠肝细胞的细胞凋亡率(6.8%)明显增高.结论:X蛋白可在体外和体内诱导细胞凋亡.     

FHIT对急性髓系白血病细胞HL60影响的研究

目的:进行外源FHIT基因转染人白血病细胞缺乏FHIT表达的HL60,研究FHIT基因对转染细胞生长的生物学影响。方法:构建pEGFP-FHIT真核表达质粒（实验组）与质粒pEGFP-N1（对照组）。分别电穿孔法转染HL60细胞。应用荧光显微镜、RT-PCR、Western blot检测转染基因的转录和表达情况。四甲基偶氮唑盐（MTT）法、流式细胞术研究转染基因对HL60细胞体外增殖、凋亡情况的影响,并与转染对照质粒的细胞株进行比较。结果:经PCR、酶切和DNA测序证实pEGFP-FHIT真核载体构建成功。荧光显微镜下实验组HL60细胞可见绿色荧光,转染率为40%。RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测到FHIT的表达。MTT检测结果显示:转染后实验组抑制率明显升高,细胞增殖受到抑制（P＜0.05）。流式细胞术结果显示:实验组细胞凋亡率明显增加（P＜0.05)。结论:转染FHIT基因对白血病细胞HL60的生长有抑制作用,并能诱导其凋亡。     

Survivin反义RNA/HSP70双基因转染对HepG2细胞的影响

目的:探讨survivin反义RNA/HSP70双基因转染对肝癌细胞系HepG2的影响.方法:将已成功获得的双基因载体(pIRES2-ECFP-survivin反义RNA/HSP70)用脂质体介导转染肝癌细胞系HepG2,转染72小时,收集各组细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染后的细胞,通过RT-PCR、western-blot检测转染后细胞中survivin mRNA、survivin蛋白及HSP70蛋白表达的变化.结果:转染双基因载体与转染空载体的肝癌细胞系HepG2于倒置荧光显微镜下可见绿色荧光;转染双基因载体的HepG2细胞与转染空载体的HepG2细胞和未转染的HepG2细胞相比,survivin mRNA和survivin蛋白表达水平降低,而HSP70蛋白表达升高.结论:Survivin反义RNA与HSP70双基因转染成功;survivin反义RNA能干扰HepG2内源survivin的表达,HSP70能上调HepG2细胞HSP70蛋白的表达.     

一种用流式细胞术检测基因转移效率的新方法

背景与目的：基因转移效率一直以来都是用表达报告基因的细胞（显色或发荧光）占细胞总数的百分比（即转染率）来表达,此百分比是由研究者借助显微镜（或荧光显微镜）计数得出来的。该方法（本文称为人工计数法）存在客观性、准确性不够和工作量大、且不能同时检测基因表达效率等问题。本研究拟寻找一种客观、准确、简便地检测基因转移和表达效率的新方法。方法：以绿色荧光蛋白（GFP）基因为目的基因、重组腺病毒（AdCMV/GFP)为基因载体,用人工计数法测定其对肝癌细胞株HepG2的转染率;用流式细胞术（flow cytometry,FCM)测定其对肝癌细胞株HepG2、Bel7402、Hep3B、SMMC7721和鼻咽癌细胞株CNE－2的转染效率和GFP（绿色荧光蛋白）基因的表达效率（以荧光指数表示）。结果：以FCM测得AdCMV/GFP对HepG2的转染率与载体量呈对数相关（与人工法相似,但前者略高）,荧光指数与载体量呈线性相关（γ＝0．9984）,其它细胞株的结果与HepG2相似。结论：采用FCM法测定基因转移效率克服了主观因素的影响,测定结果客观准确,可以用于测定基因载体对真核细胞的转染效率,或研究转录调控元件的功能。     

HPV18 E6E7 反义荧光真核表达载体的构建及其在宫颈癌HeLa 细胞中的表达

 目的 构建HPV18型E6E7反义荧光真核表达载体,并观察其对宫颈癌HeLa细胞中HPV18 E6和E7基因表达的影响,探索反义技术用于治疗临床HPV感染及宫颈癌的可能性。方法 以HPV18型全基因质粒为模板,PCR法扩增HPV18型E6E7区716bp片段,利用基因重组技术将目的片段反向插入荧光真核表达载体pEGFP-C1,EcoR I酶切并测序鉴定;采用脂转法将重组质粒pEGFP-HPV18 E6E7as（EGFP-18AS）转染宫颈癌HeLa细胞株,通过RT-PCR及western blot检测细胞中E6、E7 mRNA和蛋白的表达。结果 成功构建HPV18E6E7反义荧光真核表达载体EGFP-18AS,经脂质体转染HeLa细胞,48h后在荧光倒置显微镜下可见明显的绿色荧光,且细胞中E6、E7 mRNA及蛋白表达水平均明显下调。结论 反义荧光真核表达载体可以有效的抑制HPV18E6、E7癌基因的表达,为治疗HPV感染和宫颈癌提供了一种新的方法。     

自噬基因Beclin1对宫颈癌HeLa细胞生长影响的体内外研究

目的 研究自噬基因Beclin1在宫颈癌细胞株HeLa中过表达对HeLa细胞体内外生长的影响.方法 构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Beclin1,转染HeLa细胞[pcDNA3.1(+)-Beclin1组],同时设空载体转染组[pcDNA3.1(+)组]和空白对照组.采用荧光定量PCR和Western blot法检测3组HeLa细胞中Beclin1 mRNA和蛋白的表达变化,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测3组HeLa细胞生长的变化,采用流式细胞术检测3组HeLa细胞的凋亡情况,采用单丹磺酰尸胺染色检测3组HeLa细胞的自噬情况.将3组HeLa细胞分别接种于裸鼠皮下,观察体内成瘤性和生长情况.结果 pcDNA3.1(+)-Beclin1组、pcDNA3.1(+)组和空白对照组HeLa细胞中Beclin1 mRNA的表达水平分别为994.718 ±468.764、0.570±0.121和0.736±0.251.pcDNA3.1 (+ )-Beclin1组HeLa细胞中Beclin1 mRNA的表达水平较pcDNA3.1(+)组和空白对照组明显增高(P＜0.05),而pcDNA3.1(+)组与空白对照组间的差异无统计学意义(P＞0.05);3组HeLa细胞中Beclin1蛋白的表达情况与mRNA相似.pcDNA3.1(+)-Beclin1组的自噬细胞率为10.9％,明显高于空白对照组和pcDNA3.1(+)组(分别为2.5％和3.1％,P＜0.05).pcDNA3.1(+)-Beclin1组HeLa细胞的凋亡率为(28.2±2.3)％,明显高于pcDNA3.1(+)组和空白对照组[分别为(14.6±4.6)％和(11.2±3.0)％,P＜0.05].Beclin1在HeLa细胞中过表达可抑制肿瘤细胞在体外的生长,抑制率为58.7％;并可使HeLa细胞在裸鼠体内成瘤时间延长,瘤体体积和重量明显小于pcDNA3.1 (+)组和HeLa组(P＜0.05),抑瘤率为52.2％.结论 自噬基因Beclin1过表达可抑制HeLa细胞在体内外的增殖,促进细胞的自噬与凋亡,为宫颈癌基因治疗提供了新的选择途径.     

Development of a hypoxia-inducible cytosine deaminase expression vector for gene-directed prodrug cancer therapy

One important feature of human solid tumors is the presence of a hypoxic microenvironment. Under hypoxia, genes that contain a hypoxia-response element (HRE) can be activated by the binding of hypoxia-inducible factor-1. To reach the goal of selectively killing tumor cells in a hypoxic microenvironment using a gene therapy approach, we developed a cytosine deaminase (CD) gene construct (pH9YCD2) that contains an HRE gene enhancer. CD is an enzyme that catalyzes the conversion of noncytotoxic 5-fluorocytosine (5-FC) to the cytotoxic and radiosensitizing drug 5-fluorouracil (5-FU). Yeast CD was cloned into an SV40 promoter-based mammalian expression vector, and an HRE enhancer was inserted in front of the promoter. Human glioblastoma U-87 MG cells were transfected with pH9YCD2. Western blots revealed that CD was strongly expressed under hypoxic conditions (0.3-1% O2), whereas only minor CD expression was seen under normoxic conditions. To confirm that the expressed CD enzyme retains catalytic activity, we performed a 5-FC/5-FU-conversion assay in which 5-FC was incubated with the lysates of pH9YCD2-transfected cells. The percentage of conversion from 5-FC to 5-FU was 63% under hypoxia versus 13% under normoxia. In vitro, cell viability and colony-forming efficiency assays demonstrated that the gene construct was able to significantly kill glioblastoma cells in a hypoxia-dependent manner. In addition, 5-FC treatment of hypoxic pH9YCD2-transfected cells produced a marked bystander effect, which could be a distinct advantage for gene therapy. If this construct exhibits antitumor efficacy in vivo, it may have promise as an antitumor agent in humans.     

胆固醇酯转运蛋白对人宫颈癌HeLa细胞辐射增敏性的影响

目的:研究胆固醇酯转运蛋白(cholesteryl ester transfer protein,CETP)高表达对宫颈癌HeLa细胞放射敏感性的影响。方法:采用脂质体介导法将构建插入全长CETP基因的pcDNA3载体转染人宫颈癌HeLa细胞,获得稳定高表达CETP的HeLa细胞,同时转染pcDNA3空质粒为对照;克隆形成实验检测细胞的存活率;FCM法检测细胞的凋亡率;蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)的表达。结果:X-射线照射后,CETP高表达的HeLa-CETP细胞的放射增敏比SERD0和SERDq分别为1.42和2.09,而未转染细胞与转染空质粒的细胞照射后,细胞存活率差异无统计学意义。FCM结果显示,在X-射线照射后,HeLa-CETP细胞的凋亡率明显高于未转染细胞与转染空质粒的细胞(P<0.05)。蛋白质印迹法检测结果显示,提高CETP的表达可以降低抗细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和NF-кB的表达,而增加促细胞凋亡Bax蛋白的表达。结论:导入外源性CETP基因,提高HeLa细胞中CETP表达水平可明显增加HeLa细胞的放射敏感性,其作用机制可能与增加辐射诱导细胞凋亡和改变凋亡相关蛋白的表达有关。     

转染野生型p53基因对人肺腺癌细胞作用的研究

目的研究外源性野生型p53基因对人肺腺癌细胞系GLC-82的生物学作用.方法将含有野生型p53基因的pDOR-neo逆转录病毒载体,通过Lipofectin转染GLC-82细胞,采用流式细胞分析、电镜下观察、3H-TdR掺入试验、软琼脂培养集落形成率测试及裸小鼠成瘤性实验,观察野生型p53基因对GLC-82细胞的生物学效应.结果电镜下观察可见,转染野生型p53基因可使GLC-82细胞出现一些病理现象,如细胞质中有明显的空泡及线粒体肿胀;流式细胞仪分析结果显示,野生型p53基因可阻止GLC-82细胞周期停止于G1-S区域;3H-TdR掺入试验结果提示野生型p53基因能够抑制GLC-82细胞的DNA合成,软琼脂培养集落形成率减少及裸小鼠成瘤减慢.结论转染野生型p53基因可抑制GLC-82细胞恶性增殖.     

B7-1/GFP基因真核表达载体的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达

Objective： To construct eukaryotic expression vector containing B7-1/GFP geneand study its expression in osteosarcoma cell line LM8. Methods： By using gene cloning technique, eukaxyotic expression vector pEGFP-C1 was used to construct the murine B7-1 recombinant plasmid （pEGFP-C1/B7）. Recombinant plasmid was transfected into LM8 cells with liposome and was confirmed by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing. The expression of the fusion protein was detected using fluorescence microscope and Western blot analysis. Results： The recombinant eukaryotic expression plasmid pEGFP-C1/B7 was successfully constructed, which was confirmed by DNA sequencing, RT-PGR and restriction enzymes analysis. The green fluorescent protein could be detected in the transfected LM8 with fluorescence microscope. The expected B7-1 and green fluorescent protein （GFP） fusion protein was detected by RT-PCR and Western blot. Conclusion： The eukaryotic expression vector containing B7-1/GFP gene was constructed successfully, and it could be expressed in LM8 after transfection.     

hif-1α基因沉默对宫颈癌HeLa细胞增殖及对顺铂敏感度的影响

目的研究靶向干扰hif-1α基因表达后,对HeLa细胞增殖及其对顺铂敏感度的影响。方法构建针对hif-1α基因的干扰载体并转染HeLa细胞,G418筛选阳性克隆,经RT-PCR与Western blot鉴定抑制效果,用MTT法观察抑制hif 1α基因表达后,HeLa细胞增殖的变化,RT-PCR检测在低氧培养条件下HeLa/shRNA-i细胞葡萄糖转运蛋白1 mRNA的水平,利用MTT法观察抑制hif-1α表达后HeLa细胞对顺铂敏感性的改变。结果HeLa/shRNA-i细胞与对照细胞组相比,hif-1α基因mRNA表达降低了62%,蛋白表达明显降低,MTT显示细胞吸光度值降低,低氧条件下葡萄糖转运蛋白1 mRNA表达降低,对顺铂药物的敏感度增高,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论hif-1α基因的沉默可以抑制HeLa细胞的增殖并且能够增强HeLa细胞对顺铂的敏感度。