促甲状腺素化学发光免疫定量检测试剂盒的研制

目的:研制人血清中促甲状腺素(TSH)的化学发光免疫检测试剂盒.方法:采用辣根过氧化物酶标记的抗TSHβ亚单位特异性单克隆抗体(mAb),与固相包被的抗TSHα亚单位的另一mAb配对,以鲁米诺作为底物,采用两步法建立了双位点夹心法人血清TSH的化学发光免疫定量分析法.结果:该方法灵敏度为0.0788 mIU/L,批内CV平均为4.7%,批间CV平均为8.4%,平均回收率为93.05%.该检测与LH、FSH和HCG无交叉反应.部分实验样品的测试结果显示该试剂与国外同类试剂(雅培architect i2000)的测定结果明显相关(r＝0.984).结论:该方法具有较高的灵敏度、重复性和准确度,与其他同类产品相比简便、快捷、成本低,适于临床检测和科研应用.     

磁分离酶联免疫法检测IL-4方法的建立

建立磁分离酶联免疫法定量检测人白细胞介素4(IL-4)的方法.用异硫氰酸荧光素(FITC)和碱性磷酸酶(AP)分别标记识别不同表位的两种抗IL-4单克隆抗体(mAb), 用抗FITC多抗或mAb包被免疫磁珠.结果显示: 检测标准品浓度在0-3ng/mL范围内线性关系良好, 敏感性达10pg/mL, 平均回收率为101.7%,批内批间CV均为3.6%,与ELISA比较相关系数为0.9124.此法所需样本量少, 方法稳定, 敏感性高和特异性强, 又无放射性污染, 在临床检验和基础研究中有较大应用价值.     

人绒毛膜促性腺激素游离β亚单位磁分离酶联免疫方法的建立

目的建立一种新的测定人绒毛膜促性腺激素游离β亚单位(hCGβ)磁分离酶联免疫分析法(MEIA)。方法用识别不同表位的两株单克隆抗体(mAb),一株mAb用FITC标记,另一株用碱性磷酸酶(AP)标记;以偶联羊抗FITC抗体的磁珠作为固相,以酚酞单磷酸酯溶液为底物,建立测定hCGβ磁分离酶免疫测定法。结果本MEIA法的灵敏度为0.1IU/L,批内CV小于8.5%,批间CV小于14%,平均稀释回收率为92.5%;与促黄体生成激素(leuteinizinghormone,LH)、促甲状腺激素(thyroidstimulatinghormone,TSH)和促卵泡成熟激素(folliclestimulatinghormone,FSH)均无交叉反应,与完整的hCG(1000IU/L)的交叉反应为1.2%,有效期不低于14个月。结论本方法的性能优于现有的放射免疫(RIA)和ELISA试剂盒,接近进口同类试剂的水平,有助于为市场提供一种高质量而价廉的hCGβ测定试剂盒。     

化学发光微粒子免疫法检测鳞状上皮细胞癌抗原的方法学评价

目的 对化学发光微粒子免疫法检测鳞状上皮细胞癌抗原(SCC Ag)进行方法学评价及性能验证.方法 对化学发光微粒子免疫法检测鳞状上皮细胞癌抗原的不精密度、回收率、线性分析、定量可报告低限值、特异性和灵敏度、反复冻融试验以及参考范围验证等方面进行评价.结果 化学发光微粒子免疫法检测鳞状上皮细胞癌抗原低、中、高值样本批内不精密度CV％分别为3.88％、2.80％和0.69％,批间不精密度CV％分别为3.98％、3.10％和3.17％;回收率为95.77％～102.25％,平均回收率为98.89％;线性分析R2为0.9997;定量可报告低限值为0.21ng/mL,CV％为15.06％;特异性为96％,灵敏度为94％;低、中、高值样本反复冻融试验CV％分别为7.99％、2.97％和1.36％;参考范围验证的检测结果均＜1.3ng/mL.结论 化学发光微粒子免疫法检测鳞状上皮细胞癌抗原方法符合实验室要求,检测性能良好,可广泛在实验室开展应用.     

促甲状腺素光激化学发光免疫测定法的建立和初步应用

采用光激化学发光免疫测定法(LICA)技术建立促甲状腺素(TSH)快速定量检测方法。采用两株针对TSH不同表位的单克隆抗体,一株单抗包被发光微粒,另一株为生物素化单抗,两者与链亲和素包被的感光微粒一起构建双抗体夹心LICA。数据处理采用双对数函数处理程序。方法的灵敏度为0.015mIU/L;批内CV为2.5%～3.6%,批间CV为2.6%～4.4%;平均回收率为100.60%。与时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)比对,相关系数达0.9681;与TRFIA临床测定值呈明显相关;正常值范围为0.33～3.09mIU/L。本文建立的TSH光激化学发光免疫测定法是目前TSH检测中最快速灵敏的方法之一,该方法稳定性好,具有很好的应用前景。     

磁分离酶联免疫荧光法(MEIF)检测人血清中胰岛素

目的:采用磁微粒分离酶联免疫荧光(MEIF)分析技术建立一种简便、高敏感性、定量检测人血清胰岛素(insulin)的新方法.方法:选用2株识别人胰岛素不同表位的单克隆抗体(mAb).一株mAb用异硫氰酸荧光素(FITC)标记, 另一株用碱性磷酸酶(AP)标记;偶联羊抗FITC抗体的磁珠用作固相分离载体, 4-甲基磷酸伞型酮用作荧光底物.结果:成功建立了定量检测人血清胰岛素的MEIF, 灵敏度2.0 μIu/mL, 线形范围0～188.52 μIu/mL, 批内变异系数(CV)为4.3%～5.2%, 批间CV为2.6%～9.5%, 稀释回收率为93%～117%, 加标回收率为94%～113%.实际样品的测定结果与倍爱康公司商品化人insulin磁分离发光系统检测试剂盒的检测结果比较, 具有良好的相关性.结论:MEIF定量测定人insulin方法成本低、灵敏度高、稳定性好, 在临床免疫检测领域具有广阔的应用前景.     

氯霉素磁分离酶联免疫(MEIA)检测方法的建立

目的:采用磁分离酶联免疫分析法(MEIA)建立定量检测氯霉素(CAP)的一种高灵敏度方法.方法:采用免疫竞争法,用异硫氰酸荧光素(FITC )标记抗CAP抗体,碱性磷酸酶(AP)标记CAP,以羊抗FITC抗体包被的免疫磁珠作为固相分离载体,单磷酸酚酞做显色底物,建立检测CAP的MEIA法.结果:成功建立了检测CAP的MEIA法,检测时间为40 min,检测灵敏度为0.03μg/L,线性范围为0.1～8.1μg/L,批内变异系数(CV) 3.9%-5.3%,批间CV 4.8%-8.1%,回收率为97%～101.5%,与国标方法液相色谱一串联质谱法的检测结果对比,相关系数r=0.9817.结论:检测CAP的MEIA法的灵敏度及准确率高、检测时间短,为食品中氯霉素残留的监测提供了一种新的免疫分析方法.     

C-肽双标记液相IRMA方法的实验研究

本文探讨应用两株高特异性配对C-P McAb分别标记125I和异硫氰酸荧光素(FITC),采用抗FITC磁性微粒子固相抗体作为分离剂,建立血清C-P IRMA检测法。结果表明,本法标准曲线范围为0.125~4.0pmol/mL,灵敏度为0.06 pmol/mL,批内批间CV分别为5.6%和8.7%,回收率为92.1%~96.0%,和胰岛素交叉反应为零。各项技术参数表明本法操作简便快速,为今后开发肽类的IRMA检测提供了特异性更高的手段。     

促甲状腺激素生物素-亲和素酶促化学发光免疫分析方法的建立

目的建立一种低成本、高灵敏度的检测血清促甲状腺激素(TSH)的生物素-亲和素酶促化学发光免疫分析方法。方法引入生物素-亲和素放大系统,一株抗TSH的单克隆抗体包被微孔板,另一株标记生物素,辣根过氧化物酶标记链亲和素,鲁米诺作为发光底物,采用夹心法,建立TSH酶促化学发光免疫分析方法。结果方法分析灵敏度为0.01mIU/L,批内变异系数为2.01%～5.40%,批间变异系数为2.96%～17.9%,回收率为90.6%～114.4%,高值促甲状腺激素血清样品经系列倍比稀释后,测定值与稀释度呈线性关系,相关系数大于0.99,与原子高科TSH免疫放射分析方法和罗氏电化学发光分析法的测定值具有良好的相关性。结论生物素-亲和素TSH酶促化学发光免疫分析方法具有成本低、灵敏度高、特异性高和稳定性好的特点,具有广阔的应用前景。     

小鼠抗星形胶质细胞上调基因1(AEG-1)单克隆抗体的制备及应用

目的制备并纯化具有高特异性的抗星形胶质细胞上调基因1(AEG-1)单克隆抗体(mAb),并进行异硫氰酸荧光素(FITC)标记,鉴定标记的mAb与肿瘤细胞的结合能力。方法小鼠腹水诱生法制备并纯化抗AEG-1 mAb,Western blot法和免疫组织化学染色检测mAb的纯度及免疫活性。流式细胞术检测FITC标记mAb的标记效率,流式细胞术及免疫细胞化学染色检测FITC标记mAb与肿瘤细胞的结合能力。结果纯化得到了具有较高纯度的抗AEG-1 mAb,免疫活性良好;流式细胞术检测结果显示,FITC标记的mAb标记的肿瘤细胞表面荧光强度明显增加,标记率可达到90%以上;FITC标记的mAb可特异性识别并结合AEG-1阳性表达的肿瘤细胞,还能与小鼠体内注射的肿瘤细胞结合,在BALB/c小鼠血液中可检测出荧光染色阳性的肿瘤细胞。结论成功制备出小鼠抗AEG-1 mAb并进行了FITC标记,标记的mAb在体内外均可与肿瘤细胞特异性结合。     

人促甲状腺激素（hTSH）ELISA的建立

采用抗ｈＴＳＨ单抗８Ｅ７包被聚苯乙烯４０孔板作为固相抗体，另用高滴度的兔抗ｈＴＳＨ多抗作液相抗体，以辣根过氧化物酶标羊抗兔ＩｇＧ作为标记第二抗体为反应的显示系统，以邻苯二胺作底物，４５０ｎＭ吸收值计算ｈＴＳＨ浓度，建立了高灵敏度的ｈＴＳＨ酶免吸附测定法（ＥＬＩＳＡ）。灵敏度为０．０３ｍＩＵ／Ｌ。批内ＣＶ１．４～６．７％平均５．４％（ｎ＝２０）批间ＣＶ为７．０％。方法特异性鉴定显示与其他糖蛋白激素无明显的交叉反应性。添加回收及稀释度试验鉴定均表明方法重复性、准确性、线性相关都符合临床应用标准。应用本法与瑞士Ｓｅｒｏｎｏ公司出品的酶免磁颗粒分离药盒同时测定１３０例，相关系数为０．９３。     

A mouse monoclonal antibody to the TSHR

INTRODUCTION: Mouse monoclonal antibodies (mAbs) with the ability to inhibit thyrotropin (TSH) binding to the TSH receptor (TSHR) are useful tools to study TSH-TSHR interaction. The 3C3 mAb we produced was found to inhibit binding of TSH to human (h)TSHR but not to porcine (p)TSHR. MATERIAL/METHODS: Purified 3C3 immunoglobulin G (IgG) and its antibody-binding fragment were prepared using standard methods and their ability to inhibit TSH binding to hTSHR or pTSHR was analyzed using a coated tube assay. The TSHR epitope reactive with 3C3 IgG was determined using Western blotting, ELISA based on peptides corresponding to the TSHR sequence, and the SPOT synthesis technique. RNA was isolated from 3C3 hybridoma cells and the mAb variable (V) region genes were sequenced and analyzed. RESULTS: 3C3 mAb had a 1 x 108 l/mol binding affinity to the hTSHR as assessed by Scatchard analysis. 3C3 reacted with the hTSHR region between amino acids (aa) 212-230, and two aa differences were found between the corresponding regions in the hTSHR and pTSHR. The light chain (LC) genes of 3C3 were derived from the Vk21 germ-line (97.6% homology) and Jk2 genes. The heavy chain (HC) genes were from the V130 germ-line (94.6% homology) combined with a D gene (not identified) and JH3 gene. The replacement/ silent mutation ratios of 6.0 and 6.5 for the LC and the HC V regions, respectively, indicated that 3C3 underwent antigen-driven maturation. CONCLUSIONS: Mouse mAbs of this type should be useful in studying the interactions between the TSHR, TSH, and mAbs in more detail.     

湛江市新生儿三种代谢病筛查报告

目的介绍湛江市新生儿筛查的情况及意义,评价该实验室的检测能力.方法对7年来湛江市出生的113 000例新生儿进行筛查.TSH检测应用酶免疫荧光法;Phe检测应用荧光法;G6PD检测应用荧光斑点法.结果 CH发病率1/3139,G6PD缺乏发病率4.65%,检出PKU患儿1例.3种疾病筛查的室间质量控制临床判断结果与反馈结果符合率100%.室内质量控制结果TSH C1变异系数26.4%,C2变异系数9.1%;Phe C1变异系数11.6%,C2变异系数8.6%;G6PD的室内质量控制结果与标准值符合率100%.结论该新生儿筛查实验室的室间及室内质量控制结果达到了权威组织者的要求,表明其实验结果是准确可靠的.通过新生儿筛查能使CH、PKU及G6PD缺乏患儿得到早期诊断治疗,避免发生体格和智能发育障碍.     

Development of a lateral flow immunoassay for the detection of total malachite green residues in fish tissues

We developed a sensitive lateral flow immunoassay (LFI) for the detection of total malachite green (MG) residues in fish tissues. LFI was based on a colloidal gold nanoparticle-labeled monoclonal antibody against MG , which was generated by fast immunization of carboxymalachite green-bovine serum albumin. The half-maximum inhibition concentration (IC₅₀) of MG monoclonal antibody (MG mAb) was 0.057 ng/ml with a linear range of 0.020–0.162 ng/ml. Following the optimization of LFI, a qualitatively visual limit of detection of 1 ng/ml and a semi-quantitatively limit of detection of 0.418 ng/ml (IC₅₀ of the calibration curve) were obtained for total MG residues in 8 min. Cross-reactivity with most MG analogs was negligible, expect with crystal violet (CV; 78.6% cross-reactivity). LFI is a novel and sensitive assay based on MG mAb that has applications for the rapid detection of total MG and CV in fish products.     

一种快捷、定量检测烟曲霉GM抗原双mAb夹心ELISA的方法

目的 :建立一种快速诊断烟曲霉病的双mAb夹心ELISA法。方法 :应用 4株抗烟曲霉GM单克隆抗体 (mAb) ,分别包被和制备HRP mAb ,用双mAb夹心ELISA法配对试验 ,选择捕获及检测mAb。结果 :经筛选得到捕获及检测mAb的最佳组合 ,并建立了双mAb夹心ELISA法。该法检测GM抗原的灵敏度为 0 .1μg/L ,测出范围在 0 .1～ 10 μg/L之间。连续 6d用ELISA法检测同一份样品 ,所获CV的平均值为 ( 7.2± 3.8) %。结论 :建立了一种可快速、定量检测烟曲霉GM抗原的双mAb夹心ELISA法 ,灵敏度高、重复性好 ,对研制试剂盒应用于烟曲霉病早期诊断和防治 ,具有重要的临床应用价值     

Establishment of an ELISA system of N1,N12-diacetylspermine in human urine

OBJECTIVE: It is known that two kinds of Diacetylpolyamine, N1,N12-Diacetylspermine(DiAcSpm) and N1,N8-Diacetylspermidine(DiAcSpd), are excreted in urine. Although these two substances are 0.4% and 1.2% of the whole polyamine, respectively, these substances may be important for a sick diagnosis. The aim of this study was to develop a sensitive and specific method for detecting DiAcSpm. METHODS: We developed a new competitive ELISA system for the measurement of DiAcSpm in human urine, using polyclonal antibodies against DiAcSpm. RESULTS: The lower limit of detection of this ELISA was 4.53 nM/assay. The higher limit of detection was 145 nM/assay. Mean recovery was 101% (range, 96.3-108%). The coefficients of variation (CV) for within-run measurements by this method were 4.87% (mean = 95.5 nM) and 5.20% (mean = 32.4 nM), and the between-run CV were 7.53% (mean = 101 nM) and 9.46% (mean = 33.8 nM). CONCLUSIONS: We have established an ELISA system for the quantification of urinary DiAcSpm that uses novel polyclonal antibodies. Our ELISA system is simple and sensitive.     

抗HIV p24和人A型红细胞双特异性单克隆抗体的研制

目的：制备抗HIV p24和人A型红细胞双特异性单抗(mAb)，并建立检测HIV p24的间接血凝试验。方法：将分泌抗HIV p2d mAb的杂交瘤株2-E4和分泌抗人A型红细胞mAb的杂交瘤株S2，分别用8-Ag和5-BrdU驯化，使成为HAT敏感株。将两者常规融合，筛选分泌双特异性mAb的杂交-杂交瘤株。然后制备并纯化双特异性mAb，用其建立的间接血凝法检测p24。结果：共获得6株杂交-杂交瘤细胞株，以其分泌的双特异性mAb建立了检测HIV p24的间接血凝法，敏感性可达400ng/L。结论：获得可稳定分泌双特异性mAb的杂交-杂交瘤株，并用纯化的双特异性mAb建立了快速检测HIV p24的间接血凝法。     

化学发光磁酶免疫法检测O157:H7大肠埃希菌

目的：建立灵敏稳定检测O157：H7大肠埃希菌的化学发光磁酶免疫法.方法：利用AMPPD-ALP化学发光体系,通过磁珠酶联免疫法对O157：H7大肠埃希菌进行检测.结果：其检测灵敏度达到850个,线性范围为1 000～50 000个,批间变异小于15%,批内变异小于20%,与人工计数培养检测相比相关系数达0.9807.结论：化学发光磁酶免疫分析法操作简便,检测精密度和灵敏度高,是一种很有发展前景的可靠方法.