基于多重PCR技术检测蜡样芽胞杆菌3种毒素基因方法的建立及评价

目的 基于多重PCR技术,建立一种快速检测蜡样芽胞杆菌nhe、cytK和entFM 3种毒素基因的方法,并评价其效能。 方法 煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,以蜡样芽胞杆菌nhe、cytK和entFM特异性毒素基因作为靶基因,采用NCBI primer-BLAST 5.0软件设计特异性引物,优化反应体系。建立三重PCR检测体系,并检测其特异性、灵敏度和稳定性。 结果 煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,浓度为227 mg·L^－1,纯度为1.50~1.60。采用多重PCR体系同时检测蜡样芽胞杆菌3种毒素致病基因,于退火温度56 ℃时,蜡样芽胞杆菌基因引物nhe499的扩增片段为499 bp,基因引物cytK191的扩增片段为191 bp,基因引物entFM363的扩增片段为363 bp。PCR体系扩增蜡样芽胞杆菌3种毒素基因后条带清晰明亮,且无非特异性条带,与金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌均无扩增,表明蜡样芽胞杆菌基因引物nhe499、cytK191和entFM363特异性强;3种引物在同一反应体系中互不干扰。灵敏度检测,多重PCR体系最低检测限可同时达到10^－1 mg·L^－1;稳定性检测,多重PCR体系自制备起每6个月检测稳定性一致。 结论 建立的多重PCR检测体系对于蜡样芽胞杆菌nhe499、cytK191和entFM363 3种毒素基因灵敏度高、特异性强,检测结果准确稳定,检测体系具有良好稳定性,适用于快速检出蜡样芽胞杆菌的3种不同致病毒素基因。     

多重PCR检测蜡样芽胞杆菌的研究

目的 建立多重PCR方法检测蜡样芽胞杆菌.方法 根据蜡样芽胞杆菌(B.cereus)的hblA、hblC、nheA、nheB、cytK、cer、entFM、bceT基因和苏云金芽胞杆菌(B.thuringiensis)的cry基因设计引物,优化反应条件.应用单一引物PCR和国标法对多重PCR反应结果进行确认.结果 蜡样芽胞杆菌溶血性基因hblA和hblC检出率为57.5％和25.0％,非溶血性基因nheA、nheB检出率分别为75.0％和80.0％,细胞毒素cytK基因检出率为37.5％.肠毒素entFM和bceT检出率分别为28.7％和18.7％.蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌cer基因检出率分别为97.5％和100.0％,cry基因检出率为分别为0.0％和100.0％.cer基因和cry基因同时检测,条带区分清晰,可作为蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌快速鉴别的首选方法.结论 三重PCR结果非常好,三对引物所扩增出的DNA条带明显区分开,电泳条带清晰,敏感度高,特异性强.单重PCR和三重PCR检测结果没有显著性差异.     

战备消毒包内细菌来源分析

[目的]探讨高原地区自然环境中战备消毒包内细菌来源.[方法]根据战备消毒包内金黄色葡萄球菌、木糖葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌和人葡萄球菌筛选战备仓库空气同种细菌不同菌株,提取基因组DNA,以其为模板,对16SrRNA和23SrRNA的转录间隔区(internal transcribled spacer,ITS)序列进行PCR扩增,将扩增产物回收测序,结果用Blast进行比对.[结果]金黄色葡萄球菌、木糖葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌和人葡萄球菌DNA PCR扩增产物分别在1000 bp、1100bp、850 bp、1000 bp左右显现单一特异性条带;ITS序列相似性约为99％～100％.[结论]战备消毒包内细菌来源于空气细菌.     

核酸试纸条快速检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因方法的建立

目的 基于核酸试纸条技术,建立一种快速检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因的方法。 方法 煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,以蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因作为靶基因,采用NCBI primer-BLAST 5.0软件设计特异性引物并通过克隆转化鉴定PCR产物,建立并组装核酸试纸条,评价核酸试纸条的特异性、灵敏度和稳定性。 结果 蜡样芽胞杆菌DNA浓度为300 mg?L^－1,纯度约为1.60。PCR产物阳性条带经切胶回收、克隆转化和测序比对,与GenBank数据库中已登记的entFM相似性为100%。在pH值7.0条件下,每100 μL 胶体金溶液加入3.3 μg链霉亲和素浓度标记,质控线浓度为1.8 g?L^－1,检测线浓度为1 g?L^－1时,硝酸纤维素膜上质控线与检测线均可与PCR产物反应出现清晰的红色条带。按照最适条件组装成核酸试纸条,PCR产物6 μL,样品展开液100 μL,检测10 min后可观察结果。核酸试纸条特异性与电泳结果一致,仅蜡样芽胞杆菌为阳性结果,与金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、大肠埃希菌和沙门氏菌皆无交叉反应,为阴性结果;灵敏度检测,核酸试纸条DNA质量浓度同时降至10^－3 mg?L^－1仍可准确检测,普通PCR电泳结果显示DNA质量浓度同时降至10^－1 mg?L^－1出现目的条带,核酸试纸条比普通PCR灵敏度提高100倍;稳定性检测,核酸试纸条在第6、9和12个月进行检测稳定性一致。 结论 建立的核酸试纸条检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因灵敏度高、特异性强且具有良好稳定性,适用于快速鉴别蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因。     

实时荧光定量PCR法检测人粪便中双歧杆菌方法的建立及评价 

目的：建立利用实时荧光定量PCR法检测人粪便中双歧杆菌浓度的方法,为检测人肠道内菌群浓度提供有效手段。方法：提取60例儿童粪便样本中细菌总DNA。选择细
菌种属的特异性基因16SrRNA作为扩增区,依据双歧杆菌的16SrRNA序列共设计3条引物,以常规PCR扩增出的16SrRNA部分基因片段制作标准品,应用SYBR Green Ⅰ双链嵌合染料,对连续稀释的标准品及待测样本进行分析,建立绝对定量的标准曲线,同时计算出待测样本双歧杆菌浓度;根据可检测到的标准品最低拷贝数计算反应灵敏度;分析PCR产物熔解曲线评价反应特异性;重复检测梯度稀释的标准品,用相同浓度标准品的Ct值变异系数（CV）评价反应稳定性。结果：常规PCR扩增出双歧杆菌16SrRNA部分基因片段长度约为613 bp,测序结果正确,成功构建了双歧杆菌实时荧光定量PCR反应中的标准品;生成的标准曲线R2=0.999,最低检测限度为每个反应1.48×102个拷贝;实时荧光定量PCR产物的熔解曲线为单峰。对待测样本分批进行荧光定量PCR检测,各组间每微升1.48×103~1.48×107个拷贝浓度标准品Ct值的变异系数为2.94%、3.39%、3.54%、3.08%和3.34%。60份儿童粪便样本双歧杆菌浓度对数值为7.77±0.86（拷贝数?g-1湿便）。结论：本研究所建立的实时荧光定量PCR法敏感性高、特异性强,且重复性好,适用于检测人粪便中双歧杆菌的浓度。     

16S rRNA在检测肺炎克雷伯菌引起血流感染中的应用

目的初步建立一种对肺炎克雷伯菌引起血流感染的快速检测方法。方法应用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）,从血培养阳性瓶中提取细菌基因组DNA,以特异性引物扩增16S rRNA靶片段,同期进行细菌培养鉴定的对照。结果检测142份已知肺炎克雷伯阳性标本,65份非肺炎克雷伯阴性对照,52份双盲样本显示敏感性为100%（146/146）特异性为100%（113/113）,整个实验可在2h内完成。结论较传统的培养鉴定法而言,以16SrRNA作为实时荧光定量靶基因可快速检测肺炎克雷伯菌,具有很好的研究价值与应用前景。     

PCR快速检测细菌16S rRNA基因的初步研究

目的：建立检测细菌16SrRNA基因的PCR方法。方法:以细菌16S rRNA基因为靶序列。利用计算机软件primer5．0，Bioedit设计2条引物-pml.,pm2并建立相应的PCR方法。采用该PCR方法扩增实验室保留菌株的16srRNA基因,以人类外周血白细胞基因组DNA、HBV—DNA阳性血清以及白色念珠菌为对照。检测该实验方法的特异性;采用倍比稀释的方法进行该实验方法的敏感性实验。结果：用引物pml，pm2对17个不同菌株进行PCR扩增。均得到371bp左右长度的DNA片段。特异性实验表明,此通用引物与人类基因组DNA、真菌及病毒无交叉反应。敏感性实验表明。用pml，pm2引物进行的PCR扩增可检测出20CFU／ml,结论：16S rRNA基因PCR检测方法具有特异、敏感、快速的特点。     

新型MGB探针特异性检测变形链球菌

目的:设计一种新型TaqManMGB探针,利用实时荧光定量PCR检测变形链球菌,提高PCR法检测变形链球菌的特异性,减少检测的假阳性。方法:提取6种不同链球属细菌的DNA,分别进行巢式PCR和TaqManMGB实时荧光定量PCR,比较两种PCR方法检测变形链球菌的特异性。巢式PCR第1轮扩增的引物是细菌16S rRNA基因通用引物,第2轮扩增使用变形链球菌16S rRNA基因可变区序列的特异性引物。TaqManMGB实时荧光定量PCR的引物与第2轮巢式PCR特异性引物相同,设计的MGB探针序列与变形链球菌16S rRNA基因中特异性序列相匹配,不与其他细菌的基因序列匹配。将变形链球菌标准株的DNA样本从2.5 mg/L至0.16μg/L按5倍梯度稀释,制备出实时荧光定量PCR的标准曲线。结果:变形链球菌和格氏链球菌在巢式PCR中均扩增出282 bp的DNA片段,出现假阳性结果。TaqManMGB实时荧光定量PCR能定量检出变形链球菌标准株和临床株,不检出其他链球菌,比巢式PCR特异性更好。TaqManMGB实时荧光定量PCR对变形链球菌DNA的最低检出浓度为20μg/L。结论:本研究设计出一种针对变形链球菌的TaqManMGB探针,建立利用TaqManMGB实时荧光定量PCR特异性检测口腔中变形链球菌的方法。     

实时定量PCR检测白色念珠菌方法学的建立

目的 采用Taq Man MGB探针技术, 建立白色念珠菌实时荧光定量PCR (RQ-PCR) 检测方法, 为临床白色念珠菌的检测提供快捷的方法.方法 以真菌D1/D2区基因的一段高度保守序列为扩增靶序列, 合成白色念珠菌特异性引物和探针, 提取白色念珠菌标准菌株的DNA, 构建含有靶基因片段的重建质粒, 扩增后DNA作为标准品, 建立白色念珠菌RQ-PCR的标准曲线, 并对其重复性、敏感性及特异性等方面进行方法学评价.结果 对构建好的克隆质粒测序, 插入片段与预期片段序列一致, 相似性达100%.白色念珠菌标准曲线为Y=-3.824x+41.36, R2=0.990, 该扩增曲线形态良好.结论 成功建立了实时荧光定量PCR检测白色念珠菌的方法, 其敏感性和特异性较好.     

辽宁省2021—2022年餐饮食品蜡样芽胞杆菌毒力基因和耐药特征检测

目的 了解辽宁省2021—2022年食品中蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）污染状况、携带的毒力因子及药物敏感性的特征。方法 对辽宁省2021—2022年分离自15个监测点4大样品种类共620份样品,应用GB4789.14—2014进行分离鉴定蜡样芽胞杆菌,并用PCR方法进行菌群特异性基因groEL和gyrB及11种毒力基因检测;采用微量肉汤稀释法检测菌株对抗生素的敏感性。结果 79株蜡样芽胞杆菌都检出了蜡样芽胞杆菌毒力基因,占比较大的分别是非溶血性的肠毒素nheC、nheA和nheB,检出率分别是100.0%(79/79)、93.3%(74/79)和83.5%(66/79),肠毒素entFM基因检出率98.7%(78/79)。79株餐饮食品中蜡样芽胞杆菌携带19种毒力基因模式,基因模式中IX和XVII比例最多占到16.5%(13/79)。79株蜡样芽胞杆菌对氨苄西林、青霉素耐药率均为100.0%,对氯霉素、庆大霉素耐药率均为0;对其他6种抗菌药物的耐药率分别为：复方磺胺甲恶唑65.8%(52/79)、亚胺培南10.1%(8/79)、红霉素73.4%(58/79)、克林霉素...     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

妊娠晚期重度妊高征的监测

重度妊高征表现为高血压、蛋白尿、浮肿等症状 ,严重可以导致母婴死亡。对妊娠足月的重度妊高征 ,可以根据其临产与否及宫颈条件 ,立即决定其为阴道分娩或是剖宫产术。对于妊娠晚期的重度妊高征 ,因其胎龄不足月 ,胎儿生长发育及胎肺成熟度情况需通过一定时间的治疗 ,根据其病情变化来决定其治疗方案或终止妊娠的时机[1,2 ] 。这就需要我们对这一阶段的治疗进行监测 ,防止母儿并发症的发生。现将 2 0 0 0年至今我院收治妊娠晚期重度妊高征 30例的监测结果回顾分析如下。1　资料和方法1.1　研究对象　选择孕 31～ 36周重度妊高征 30例 ,其中 …     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

降钙素原变化率的测定对细菌性肺炎的评估价值

目的 探讨降钙素原变化率的测定对细菌性肺炎的评估价值.方法 选取住院治疗的细菌性肺炎患者72例,根据治疗效果分为治疗有效组(有效组)47例和治疗无效组(无效组)25例,对治疗有效组和无效组中的降钙素酶原变化及影响肺炎治疗效果的危险因素进行分析.结果 有效组治疗后3天及治疗后7天的降钙素酶原显著低于无效组的患者(P＜0.05);年龄＞65岁、心功能≥3级、COPD、糖尿病、肺部双侧受累(X线示)、菌血症、感染性休克和3天内降钙素酶原变化率＜30％是影响细菌性肺炎治疗效果的危险因素;感染性休克、肺部双侧受累、3天内降钙素酶原变化率＜30％及心功能≥3级是影响细菌性肺炎治疗效果的独立危险因素.结论 测定降钙素原变化率对细菌性肺炎的疗效评估具有重要临床意义,可在临床推广应用.     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。