布鲁氏菌和幽门螺杆菌等6种病原菌16S rRNA和cagA等基因的克隆与鉴定

目的克隆并鉴定布鲁氏菌的16SrRNA、支原体的16SrRNA、泰泽氏菌的16SrRNA、空肠弯曲菌的flaA、肝螺杆菌的flaB和幽门螺杆菌的cagA基因,为建立实时荧光定量PCR检测方法作准备。方法设计、合成布鲁氏菌的16SrRNA、支原体的16SrRNA、泰泽氏菌的16SrRNA、空肠弯曲菌flaA、肝螺杆菌flaB和幽门螺杆菌的cagA基因的特异性引物;PCR扩增、克隆16SrRNA、flaA、flaB和cagA基因;对重组质粒进行酶切鉴定、PCR鉴定和测序分析。结果布鲁氏菌的16SrRNA、支原体的16SrRNA、泰泽氏菌的16SrRNA、空肠弯曲杆菌的flaA、肝螺杆菌的flaB和幽门螺杆菌的ca-gA基因PCR扩增产物分别在612bp、600bp、922bp、637bp、1545bp和1168bp处出现特异性目的条带,结果均与预期扩增的目的片段大小一致。将PCR产物分别与pMD18-T载体连接并转化感受态细菌大肠埃希菌JM109。对重组质粒pT-BC16SrRNA、pT-MP16SrRNA、pT-CP16SrRNA、pT-CJflaA、pT-HHflaB和pT-HPcagA分别进行酶切鉴定及PCR鉴定,结果均可见特异性目的条带。测序结果显示,布鲁氏菌的16SrRNA、支原体的16SrRNA、泰泽氏菌的16SrRNA、空肠弯曲菌的flaA、肝螺杆菌的flaB和幽门螺杆菌的cagA基因序列与GenBank中细菌相应序列同源性高达100%,说明上述6种致病菌的16SrRNA、flaA、flaB和cagA基因已成功克隆。结论成功克隆了布鲁氏菌16SrRNA、支原体的16SrRNA、泰泽氏菌的16SrRNA、空肠弯曲菌的flaA、肝螺杆菌的flaB和幽门螺杆菌的cagA基因,为建立实时荧光定量PCR检测方法奠定了基础。     

新疆地区皮肤利什曼病病原体SSU rDNA PCR扩增及限制性酶切分析

我们采用引物R200和R300，对新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病（CL）患者的皮肤病变组织内抽提的微量利什曼原虫SSUrDNA，以及有关利什县原虫种株的SSUrDNA进行PCR扩增，然后分别采用限制住内切酶Rsal和Hhal对PCR扩增产物进行限制性酶切分析。结果显示：采用RsaⅠ进行限制性酶切分析，克拉玛依地区2例CL患者皮肤病变组织标本的PCR扩增产物经酶切后，其电泳图形与L．tropica完全相同。显示克拉玛依地区CL病原体SSUrDNA的PCR扩增产物与L．tropica存在相同的限制性内切酶图谱。     

慢性乙型肝炎患者肝组织中螺杆菌菌属特异性16SrRNA基因及HP特异性基因分析

目的对慢性乙型肝炎患者肝组织进行螺杆菌菌属特异性16SrRNA基因及幽门螺杆菌（HP）特异性基因检测,探讨螺杆菌在慢性乙型肝炎发生、发展中的作用。方法对56例行肝穿刺活检的慢性乙型肝炎患者的肝组织应用针对螺杆菌菌属特异性16SrRNA基因的通用引物进行基因扩增及微需氧分离培养,并对螺杆菌菌属特异性16SrRNA基因阳性者进一步应用HPcagA、vacA和glmM基因特异引物进行扩增。结果对56例慢性乙型肝炎患者的肝组织DNA应用螺杆菌菌属特异性16SrRNA基因通用引物进行扩增,共有35例患者的肝组织中发现了螺杆菌菌属特异性16SrRNA基因,其中肝硬化组（72.7%）和原发性肝癌组（87.5%）的检出率明显高于慢性肝炎组（42.3%,P〈0.05）,而慢性肝炎组中随着炎症评分的增加,检出率亦增加。对这35例螺杆菌菌属特异性16SrRNA基因阳性的肝组织DNA进一步应用HPcagA、vacA和glmM基因特异性引物进行扩增,结果证实有21例为HPDNA。所有肝组织经微需氧分离培养均未发现可疑菌落生长。结论慢性乙型肝炎患者肝组织中除存在HPDNA外,可能还存在其他螺杆菌DNA。螺杆菌在慢性乙型肝炎向肝硬化和肝癌的发展中可能发挥致病作用。     

用PCR—RFLP和16SrDNA指纹图法分析幽门螺杆菌基因型

本文建立了PCR－RFLP和16srDNA指纹图法．对19株幽门螺杆菌（HP）进行基因型分析：HP尿素酶C基因的PCR扩增产物．分别用HindⅢ、HaeⅢ、AluⅠ酶切，结果显示：每个酶均将19株HP分为3种RFLP图谱．综合HindⅢ，HaeⅢ和AluⅠ酶切结果，19株HP分为10个酶切带型；PCR扩增HP标准株16SrRNA基因，地高辛标记制备550bp探针，19株HPDNA分别经HaeⅢ和EcoRⅠ酶切、电泳后，通过Southern杂交获16SrDNA指纹图，结果显示：HaeⅢ酶切分为14个杂交带型，EcoRⅠ酶切19株HP杂交带型均不同。本实验表明：上述两种方法重复性好，分群力高，可准确有效地对HP作出鉴定并将其分型。19株HP株间存在基因型差异。     

赫坎按蚊种群近缘种核糖体基因内转录第二间隔区序列分析

目的　分析赫坎按蚊种群内4个近缘种核糖体基因内转录第二间隔区(rDNAITS2)特征。　方法　采用特异性ITS2引物对中华按蚊和嗜人按蚊江苏实验株、辽宁省沈阳市和朝鲜开城现场捕获的嗜人按蚊、八代按蚊和雷氏按蚊rDNAITS2进行PCR扩增、基因测序和限制性内切酶酶切位点图谱分析。　结果与结论　赫坎按蚊种群近缘种中华按蚊、嗜人按蚊、八代按蚊和雷氏按蚊rDNAITS2分别为472、452、456和456bp,各基因序列存在明显差异并存在不同的限制性内切酶酶切位点     

PCR-RFLP技术用于鉴别赫坎按蚊复合体近缘种按蚊的研究

目的区别赫坎按蚊种团内近缘种.方法应用聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)技术,对辽宁省现场捕获的按蚊用特异性ITS2引物进行PCR扩增,限制性内切酶RsaⅠ和HinfⅠ消化,琼脂糖凝胶电泳分析.结果中华按蚊的PCR扩增产物能被限制性内切酶RsaⅠ酶切成350 bp和200 bp两条酶切DNA条带;嗜人按蚊核糖体DNA(rDNA)的PCR扩增产物能被限制性内切酶HinfⅠ酶切成410 bp的酶切DNA条带; 雷氏按蚊的ITS2基因PCR扩增产物能分别被限制性内切酶RsaⅠ和HinfⅠ酶切,分别显示350 bp和400 bp的酶切DNA条带;八代按蚊的PCR扩增产物没有显示明显的限制性内切酶RsaⅠ或HinfⅠ酶切条带.结论依据rDNA的ITS2区段基因特征建立的PCR-RFLP技术可用于鉴别赫坎按蚊种团的中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4个近缘种按蚊.     

细菌DNA图谱分析幽门螺杆菌阳性病人治疗后的复发和再 …

目的：分析和比较幽门螺杆菌（ＨＰ）感染病人前和治疗后胃内分离到的细菌ＤＮＡ图谱。分析：用随机扩增多形态ＤＮＡ技术（Ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ，ＲＡＰＤ）检测９对ＨＰ菌株，多聚酶链反应采用１０个碱基对的随机引物。结果：不同ＨＰ菌株ＤＮＡ图谱显示极大差异性。６对细菌ＤＮＡ图谱治疗前与治疗后相同，提示病人感染同一细菌，１对细菌ＤＮＡ图谱治疗前与治疗后相似，提示病人体     

肝癌患者肝组织中螺杆菌感染的研究

目的　探讨螺杆菌感染是否与人类肝癌的发生相关。方法　选取经病理诊断的肝癌组织及癌旁组织 2 0例为研究对象 ,非肝癌组织 16例作对照 ,采用聚合酶链反应 (PCR)扩增螺杆菌 16SrRNA基因 (16SrDNA)检测螺杆菌 ,扩增产物经Southern杂交证实 ,并对部分标本的PCR产物进行测序及同源比较。阳性者再扩增幽门螺杆菌 (H pylori)的特异基因 (2 6 -kDa蛋白 )和相关功能基因 (cagA、vacA、glmM、rps4 )来验证是否为该菌。结果　 4 0 % (8/ 2 0 )的肝癌组织中发现螺杆菌 16SrD NA存在 ,其对应的癌旁组织大部分亦阳性 (7/ 8) ,而非肝癌组无一例阳性 (P <0 0 1)。所有PCR产物用Southern杂交得到证实。 6例测序及同源比较显示 ,肝癌组织中的螺杆菌 16SrDNA序列与H pylori的 16SrDNA序列有 98 5 %～ 99 0 %的同源性。阳性标本中 2 6 -kDa基因大部分亦阳性 (7/ 8) ,但仅 2例扩增出cagA基因 ,2例扩增出glmM基因 ,一直未扩增出vacA基因和rps4基因。 结论　肝癌患者肝组织中螺杆菌感染率较高 ,它与肝癌的发生可能存在某种联系。     

胃黏膜组织中恶臭假单胞菌临床意义的探讨

目的探索恶臭假单胞菌在幽门螺杆菌感染相关胃肠疾病中的意义。方法采集14 C尿素呼气试验阳性患者病变胃黏膜354例,进行细菌的分离培养。根据菌落形态、革兰染色、尿素酶试验及幽门螺杆菌特异性16SrRNA基因片段的PCR进行幽门螺杆菌的鉴定,同时提取胃黏膜组织DNA,通过幽门螺杆菌特异性PCR进行快速诊断。将非幽门螺杆菌转种于营养琼脂培养基,进行快速尿素酶试验。尿素酶阳性的非幽门螺杆菌染色体DNA利用细菌16SrRNA基因通用引物进行PCR扩增、测序及序列比对。使用全自动细菌鉴定仪对经测序比对为恶臭假单胞菌的菌株进行鉴定。采用K-B纸片扩散法进行药物敏感性试验。结果从354例样本中分离出革兰阴性、尿素酶阳性的恶臭假单胞菌10株,经16SrRNA基因测序和序列比对,与GenBank中恶臭假单胞菌的相似性≥98%。10株恶臭假单胞菌的胃黏膜标本中,6例标本幽门螺杆菌特异性PCR为阳性,4例为阴性。传代存活的7株恶臭假单胞菌的K-B法药物敏感试验显示对左氧氟沙星均敏感,1株对四环素敏感,5株对阿莫西林耐药,6株对克拉霉素耐药,7株对甲硝唑、氨苄青霉素均耐药。7株菌经全自动细菌生化鉴定仪鉴定结果均为恶臭假单胞菌。结论病变胃黏膜中分离出尿素酶阳性且对治疗幽门螺杆菌感染的多种抗生素耐药;可能造成临床上14 C-尿素呼气试验假阳性,并继发感染影响胃肠疾病的进展。     

16SrDNA结合显色法芯片技术鉴定分枝杆菌的方法学研究

目的建立16SrDNA结合显色法芯片技术(玻璃芯片转尼龙膜显色法)鉴定分枝杆菌的方法。方法利用GenBank中细菌16SrDNA保守区序列,设计两对分枝杆菌属特异性通用引物,采用双重PCR法同时扩增16SrDNA的2个不同片段;根据已知16种分枝杆菌的16SrDNA序列,设计合成对应的特异性寡核苷酸探针。先用通用引物PCR扩增所有标准菌株DNA,PCR产物分别与16种分枝杆菌探针的玻璃芯片杂交,通过尼龙膜显色进行分析。结果应用显色法芯片技术分析16种分枝杆菌标准菌株和5种非分枝杆菌菌株,对其双重PCR、杂交、洗涤条件进行优化。确定双重PCR最佳退火温度为52℃,在该温度下除5株非分枝杆菌外均产生2条DNA片段,大小分别为272～280bp和183～192bp;杂交温度32℃、2×SSC洗涤5min、0.2×SSC洗涤1min,16种分枝杆菌的杂交效果最好,特异性达100%。结论用显色芯片法检测16SrDNA,可准确鉴别16种分枝杆菌。     

幽门螺杆菌flaA基因的变异

目的鞭毛是幽门螺杆菌（Ｈｐ）的重要侵袭因子,本研究拟检测Ｈｐ鞭毛素Ａ基因的变异性,进而研究其与Ｈｐ致病性的关系．方法我们对５２例胃粘膜活检标本和１８株Ｈｐ临床分离株进行Ｈｐ特异的１６ＳｒＲＮＡ基因和鞭毛素Ａ基因ＰＣＲ扩增和ＰＣＲＲＦＬＰ及ＰＣＲＲＦＬＰＳＳＣＰ分析．结果对４３例Ｈｐ（＋）的ｆｌａＡ基因ＰＣＲＲＦＬＰ（ＨｉｎｄⅢ）大约可分７个型（变异检出率为１６３％）,而ＰＣＲＲＦＬＰＳＳＣＰ可分３７个型（变异检出率为８６０％）,两者有非常显著性差异．结论ｆｌａＡ基因变异性极大,ＰＣＲＲＦＬＰＳＳＣＰ优于ＰＣＲＲＦＬＰ,是检测其变异的有效方法．     

Helicobacter pylori and other Helicobacter species DNA in human bile samples from patients with various hepato-biliary diseases

AIM: To investigate the presence of Helicobacter species by nested PCR of 16S rRNA genes followed by the presence of Helicobacter pylori (H pylori) 16S rRNA, ureA, cagA genes in bile obtained at endoscopic retrograde cholangio-pancreatography (ERCP) from 60 Indian subjects. METHODS: Sixty bile samples were obtained from patients diagnosed with various hepato-biliary diseases and control subjects at ERCP. PCR analysis was carried out using primers for Helicobacter genus 16S rRNA gene and H pylori (16S rRNA, ureA and cagA) genes. Gastric H pylori status was also assessed from biopsies obtained at endoscopy from patients with various hepato-biliary diseases and controls. The control group mainly consisted of subjects with gastric disorders. Sequencing analysis was performed to confirm that PCR products with 16S rRNA and cagA primers were derived from H pylori. RESULTS No Helicobacters were grown in culture from the bile samples. Helicobacter DNA was detected in bile of 96.7% and 6.6% of groups I and II respectively. Ten from group I were positive for 16S rRNA and ureA and 9 were positive for cagA gene. In contrast of the 2 from the control, 1 amplified with 16S rRNA, ureA and cagA primers used. The sequences of the 16S rRNA genes and cagA were 99% similar to Helicobacter pylori. CONCLUSION: Helicobacters are associated with the pathogenesis of various hepato-biliary disorders.     

Isolation of Helicobacter pylori from sheep-implications for transmission to humans

OBJECTIVES: When and how Helicobacter pylori (H. pylori) originally entered the human population as well as how the infection is transmitted in different communities is unknown. We previously showed that Sardinian shepherds had almost a 100% prevalence of H. pylori and that the prevalence was higher than that of their same-household siblings. AIM: To examine whether H. pylori infection might be transmitted from sheep. METHODS: Milk and gastric tissue were cultured and analyzed by PCR amplification using three sets of primers Helicobacter genus-specific 16S rRNA and two sets of primers specific for H. pylori vacA gene. RESULTS: Helicobacter DNA was demonstrated in 60% (38/63) of milk samples and in 30% (6/20) of sheep tissue samples. H. pylori vacA gene was amplified in five of 38 milk samples, and in two of six sheep tissue samples respectively. H. pylori were cultured from sheep milk and tissue samples and confirmed as H. pylori on the basis of colony morphology, positive biochemical reactions, and negative Gram stain. Sequence analysis of 16S rRNA PCR products from these isolates demonstrated 99% identity with H. pylori. CONCLUSIONS: Together, the presence of H. pylori in sheep stomach in the absence of associated gastritis and recovery of H. pylori from sheep milk and gastric tissue suggest that sheep may be a natural host for H. pylori.     

Clarithromycin resistance and point mutations in the 23S rRNA gene in Helicobacter pylori isolates from Malaysia

OBJECTIVE: To determine the prevalence of primary clarithromycin resistance amongst Helicobacter pylori (H. pylori) strains in Malaysian patients with gastroduodenal diseases, by using restriction fragment length polymorphism (RFLP) in domain V of 23S rRNA. METHODS: Gastric biopsies were obtained from H. pylori positive patients undergoing gastroscopy. DNA extraction was followed by PCR amplification using the primers Hp23-1 and Hp23-2 flanking a region of 425bp within the bacterial 23S rRNA peptidyltranferase (Hp23S fragment). Analysis of the 23S rRNA gene mutations is based on the generation of restriction sites for two restriction enzymes: BbsI and BsaI, which correspond to the base substitutions characteristic of clarithromycin resistance from A to G at positions 2142 and 2143, respectively. RESULTS: Gastric biopsy samples were obtained from 107 patients. A fragment of size 425bp corresponding to that expected from amplification of domain V of 23S rRNA was PCR-amplified from only 105 samples. The amplicon was subsequently subjected to restriction by BbsI and BsaI. Only 1 sample (0.95%) had the BbsI mutation (base substitution at A2142G) and 2 samples (1.90%) the BsaI mutation (base substitution at A2143G). Thus 3 of 105 (2.9%) samples harbored clarithromycin resistant strains. CONCLUSION: In our experience, PCR-RFLP is a rapid and precise method to detect the resistance of H. pylori to clarithromycin. Using this method, a low prevalence of clarithromycin resistance was detected in our local Malaysian strains. This augurs well for the continued use of clarithromycin as a first line drug in the treatment and eradication of H. pylori infection.     

应用16S-23S rRNA基因区间对败血症常见菌的鉴定

目的：建立检测不同菌种细菌的16S－23S rNA基因区间的特异图谱。方法：应用聚合酶链反应（PCR），限制性内切酶片段长度多态性分析（RFLP），分子克隆及测序技术，对临床常见的代表20个属26个种的标准菌株及相应的临床分离菌株共61株进行PCR扩增，同时对临床标本进行培养并与PCR－RFLP比较，探讨其在临床应用中的价值。结果：26株不同的标准菌株行PCR扩增后，分别出现1条带，2条带，3条带及多条带的不同DNA图谱，其敏感性为2．5CFU，与人类基因组DNA，真菌及病毒无交叉反应，其中14种菌经PCR扩增即可区分，另10种经Hinf I或AluI酶切后才能区分，肺炎克雷伯菌与坚韧肠球菌间的差异在第779位碱基上不同，Xma Ⅲ酶能进行区别，临床42例血培养15例阳性，阳性率35．7％；而PCR阳性27例，阳性率达64．3％，其阳性率明显高于血培养（P＜0．01），6例脑脊液标本中1例培养为表皮葡萄球菌，其PCR也阳性，2例培养阴性标本，其PCR也阳性，经图谱分析为葡萄球菌，1例培养为新型隐球菌的脑脊液标本PCR检测为阴性，另2例PCR及培养均阴性。结论：建立了PCR加RFLP技术快速检测细菌16S－23S rRNA基因区间的方法，进一步为临床细菌感染的病原诊断提供了新的科学依据。     

幽门螺杆菌16SrDNA指纹图和PCR-RFLP基因分型研究

目的　探讨我国幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)的基因多态性及其与相关疾病之间的关系。 方法　应用PCR掺入法制备 16SrRNA基因探针 ,建立 16SrDNA指纹图技术和尿素酶C(ureC)基因的PCR -RFLP法 ,并结合统计学软件进行聚类分析 ,对临床分离的 14株Hp进行基因分型。结果　 14株Hp的 16SrDNA指纹图谱显示 10个HaeⅢ杂交带型和 12个HindⅢ杂交带型 ;ureC基因的变异度较小 ,14株Hp中有 12株PCR -RFLP图谱完全一致。通过杂交结果示意图和SPSS10 0软件进行聚类分析 ,HaeⅢ、HindⅢ及两种酶杂交结果的综合 ,均将 14株Hp分为两型。两种方法结果综合进行聚类分析 ,14株Hp在基因水平上分为三型。结论　差异显著的DNA指纹图谱说明了不同Hp菌株间基因组结构的高度变异性。 16SrDNA指纹图谱较ureC基因的PCR -RFLP谱型更敏感地表达Hp各菌株的变异 ,可准确有效地对Hp作出基因分型。未发现Hp菌株间有特异的疾病图谱存在     

立克次体的16SrRNA基因序列分析

目的　研究立克次体的１６ＳｒＲＮＡ基因序列的差异,为其分类和鉴定提供依据。方法　从基因数据库中选择不同的立克次体属代表种的１６ＳｒＲＮＡ基因序列,在计算机上用多序列排列程序对序列进行同源位排列和对比分析,以及依据序列的相似程度构建进化树。结果　立克次体的１６ＳｒＲＮＡ基因含有４ 个高变区,这些高变区的序列具有种或属的特异性,依据序列的相似程度构成的进化树可将立克次体目内成员分为柯克斯体、巴通体、立克次体、埃立克体等４ 个大基因群,每个大基因群含有若干个小基因群。结论　１６ＳｒＲＮＡ基因高变区的序列可用于设计立克次体种、属特异性ＰＣＲ引物和杂交探针;１６ＳｒＲＮＡ 基因序列的分析是目前立克次体分类和鉴定的最可靠依据     

采用通用引物PCR及RFLP快速检测下呼吸道感染常见病原菌的临床研究

目的 采用聚合酶链反应(PCR)配合限制性酶切片段多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析检测下呼吸道感染的常见病原菌,探讨其在临床快速诊断细菌感染中的应用价值.方法 在下呼吸道感染的住院患者中筛选出合格痰标本125例,分为2份,1份行痰培养作为对照,另1份以16S rRNA基因为靶序列,在其保守区建立通用引物进行PCR扩增,再分别用限制性内切酶HaeⅢ、MnlⅠ、AluⅠ、DdeⅠ和BstBⅠ酶切,进一步行RFLP分析,根据下呼吸道常见病原菌建立的特异酶切图谱诊断鉴定细菌,比较两种方法的检测结果.结果 125例合格痰标本中,PCR配合RFLP检测阳性85例,阳性率为68.0%,痰培养阳性72例,阳性率为57.6%,前者明显高于痰培养(P<0.01),其中肺炎链球菌及流感嗜血杆菌阳性率明显高于痰培养,部分革兰阴性杆菌阳性率也高于培养组,但部分革兰阳性球菌(溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌及屎肠球菌)阳性率较培养组低于痰培养.结论 PCR配合RFLP分析方法检测下呼吸道感染病原菌较常规培养方法敏感快捷,是一种具有临床应用价值的快速诊断方法.     

应用巢式PCR对恶性疟原虫培养中支原体污染的检测

目的应用巢式PCR检测恶性疟原虫体外培养中的支原体污染。方法根据支原体16s和23s保守序列设计PCR引物,应用巢式PCR检测恶性疟原虫体外培养中的支原体。结果体外培养的恶性疟原虫标本16份,PCR检测支原体均阳性,经测序比对后确认为口腔支原体。已知阴性对照无扩增带。结论应用巢式PCR能敏感和特异地检出恶性疟原虫体外培养中的支原体。