香港海鸥型菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测技术研究

目的利用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法,建立一种简便,快速,特异,灵敏的香港海鸥型菌检测方法.方法 根据香港海鸥型菌16S rDNA的保守区域设计特异性引物和探针.用不同浓度,不同温度对反应体系引物浓度,探针浓度及退火温度进行优化.用添加已知量的香港海鸥型菌样本验证方法敏感性;用香港海鸥型菌以及大肠杆菌,沙门菌,副溶血性弧菌,金黄色葡萄球菌等致病菌验证方法特异性和稳定性.结果 当25 μL反应体系中上,下游引物(10 μmol/L)各为0.6 μL,探针(10 μmol/L)为0.4 μL,模板DNA量为5.0 μL,反应条件:预变性95 ℃ 20 s ,变性95 ℃10 s,退火57 ℃ 40 s,40个循环时,香港海鸥型菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR反应Ct值与待检菌浓度对数具有良好线性关系[Ct=-3.538×log(菌浓度)+13.56,r=0.999],方法的最低检测浓度达到36 cfu/mL.23株香港海鸥型菌检测Ct值均小于35,而104株非香港海鸥型菌检测Ct值大于35或扩增曲线成一平滑直线.隔天连续5 d重复试验Ct值变异系数小于3.20件活鲤鱼,18件活草鱼香港海鸥型菌检测率实时荧光PCR检测技术显著高于常规检测方法(P <0.01,χ²=21.50).且后者所需时间为5 d,前者仅需10 h.结论 TaqMan实时荧光定量PCR法是一种快速简便,特异性强,灵敏度高的香港海鸥型菌检测方法,值得推广应用.     

Taqman-MGB双重探针PCR技术检测含89K毒力岛猪链球菌2型

目的建立同时检测猪链球菌(Streptococcus suis,SS)种特异性16S rRNA及其89K毒力岛基因的SS2中国毒力株双重荧光定量PCR方法。方法利用SS种特异性16S rRNA和89K毒力岛基因的特异性序列设计引物和MGB探针。优化荧光定量PCR反应条件和反应体系,并对21株猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)、18株其它链球菌、9株葡萄球菌、5株其它菌株进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果该技术的种特异性16S rRNA及其89K毒力岛两基因检测灵敏度分别为6个拷贝/反应(或12cfu/mL)及27拷贝/反应(或58cfu/mL);重复性实验,变异系数为0.30%～2.11%;从菌株核酸的提取至检测完成仅需2h左右。用该方法对有关菌株进行考核,21株SS2菌检测结果均为SS种特异性16S rRNA基因阳性,其中15株含有89K毒力岛的SS2菌株的89K毒力岛基因检测均阳性;而非SS菌株的16S rRNA和89K毒力岛基因检测结果均为阴性。对49份呼吸道咽拭子、血液应急样本等进行实际考核,有2份血液样本16S rRNA基因阳性,其中1份血液样本89K毒力岛基因阳性。结论本次建立的Taq Man-MGB双重探针荧光定量PCR方法特异、快速、敏感,可特异性鉴定SS2中国毒力株(含有89K毒力岛),区分SS与非SS菌以及是否含有89K毒力岛基因,该方法的建立将有益于目前针对猪链球菌2型中国毒力株快速定量检测,以及疑似猪链球菌病患者病原的早期甄别、猪链暴发疫情调查及猪群暴发或带菌调查与评估等。     

大肠杆菌肠毒素基因多重PCR检测方法的建立

目的 建立一种快速检测大肠杆菌耐热肠毒素(heat-stable enterotoxin, STa, STb)和不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin, LT-Ⅰ, LT-Ⅱ)基因的多重PCR方法。方法 参照文献合成四对可扩增产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)耐热肠毒素基因(estA、estB)和不耐热肠毒素基因(elt-Ⅰ、elt-Ⅱ)的特异性引物,通过反应条件的优化,敏感性、特异性试验和临床样品检测,建立检测大肠杆菌肠毒素的多重PCR方法。结果 用所建立的多重PCR方法可特异性扩增出estA(229 bp)、estB(480 bp)、elt-Ⅰ(605 bp)和elt-Ⅱ(300 bp)基因片段,最低检出量分别为2.55×10¹ CFU/μL、2×10¹ CFU/μL、2×10¹ CFU/μL和2.47×10³ CFU/μL。从22株大肠杆菌分离株中检测到estA基因(2/22),elt-Ⅱ基因(3/22),未检测到estB和elt-Ⅰ基因,检测结果与常规PCR检测结果一致。结论 建立了检测大肠杆菌肠毒素基因(estA、estB、elt-Ⅰ和elt-Ⅱ)的多重PCR方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,能够满足对细菌培养物的检测要求。     

应用实时荧光PCR技术检测空肠弯曲菌

目的应用实时荧光PCR技术建立一种特异、敏感的空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)检测方法。方法通过对空肠弯曲菌基因组的保守序列进行分析来设计引物及Taqman探针来实现对空肠弯曲菌的检测。结果该方法具有较强的灵敏性及特异性能够对空肠弯曲菌进行有效的检测,其对空肠弯曲菌增菌液的最低检出限为5CFU/ml而对实际样品的检测限为10CFU/g。结论该方法无需增菌培养过程能够直接对样品进行检验,较常规的生化检测方法省时省力,具有较强的实际应用价值。     

PCR法检测16S rRNA基因在败血症诊断中的价值

目的评价外周血细菌16S rRNA基因检测诊断败血症的敏感性及特异性。方法利用通用引物对6种常见细菌16S rRNA基因进行扩增，通过阳性菌株及阴性对照检测引物的特异性；观察不同退火温度及不同细菌浓度下PCR检测效果；检测败血症患者及正常人血液标本中的16S rRNA基因表达，并与血培养结果进行比较，评价其诊断意义。结果6种阳性菌株均出现特异阳性条带，阴性质控未出现阳性条带；不同退火温度对PCR结果无明显影响，以55、58℃最佳；PCR方法的最低细菌检测浓度为1．5×10^3cfu／ml；观察组血培养阳性率为38．3％（23／60），血液16S rRNA基因阳性表达率为86．6％（52／60），P〈0．01。结论PCR法检测16S rRNA基因用于败血症诊断特异性及敏感性强，但应注意规范操作、避免污染。     

基于物种特异性PCR技术检测鼻疽诺卡菌和巴西诺卡菌的初步研究

目的 建立一种可以鉴别鼻疽诺卡菌和巴西诺卡菌的双重物种特异性PCR(species-specific Polymerase Chain Reaction,SS-PCR)诊断方法。方法 基于鼻疽诺卡菌和巴西诺卡菌物种特异基因NFA_41530和O3I_RS18895分别设计特异性引物,通过优化反应条件和体系,建立快速准确的双重SS-PCR。对95株鼻疽诺卡菌、13株巴西诺卡菌和42株非目标菌株进行扩增,分析该方法的特异性和灵敏度,并通过模拟痰样本验证方法的准确性,预估其在临床诊断的价值。结果 鼻疽诺卡菌和巴西诺卡菌质检分别扩增出一条清晰且单一的目标条带,其余42株非目标菌株均未扩增,表明该方法具有很好的特异性。该方法对鼻疽诺卡菌、巴西诺卡菌的检测下限分别为1.3×10⁴ copies/μL、2.4×10⁴ copies/μL,灵敏度较高。使用20个健康人的痰液模拟痰样本,检测符合率为100%。结论 基于NFA_41530和O3I_RS18895基因建立的双重SS-PCR方法特异性强、灵敏度较高,是一种可以同时鉴定鼻疽诺卡菌和巴西诺卡菌的简便、快速、可靠、经济的方法。     

多重PCR快速检测恶性疟和间日疟的研究

目的 建立一种简便快速、能同时检测恶性疟和间日疟的核酸检测方法。方法 针对两种疟原虫18S rRNA基因设计2对(3条引物),优化引物浓度与退火温度,建立可扩增出两种疟原虫基因片段的多重PCR。并进行最低检测限确定和临床标本检测,以镜检法为金标准分析灵敏度和特异度等指标。结果 该方法可扩增出431 bp(恶性疟原虫)和341 bp(间日疟原虫)基因片段,最低检测限为10²copies/反应,检测临床标本的结果与镜检法无差别(P＞0.05),敏感度为93.55%,特异度为70.83%,阳性预测值为89.23%,阴性预测值为80.95%。结论 所建立的多重PCR方法可快速检测疟疾感染并鉴别分型,灵敏度高,值得推广。     

布鲁氏菌微滴式数字PCR方法的建立与应用

目的 建立可对布鲁氏菌准确定量的微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)方法。方法 使用以布鲁氏菌bscp31基因为靶标的引物和探针,摸索最佳的引物和探针工作浓度,确定反应体系和扩增条件,评价所建立方法的灵敏性、特异性及对疫情相关血液标本的检测效果。结果 ddPCR反应体系中最佳引物和探针浓度分别为0.8 μmol/L和0.4 μmol/L;最佳扩增条件:95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 1 min,循环40次;98 ℃酶失活10 min。布鲁氏菌核酸DNA为0.96 ng/反应~3.68 fg/反应时,ddPCR检出靶标基因拷贝数为2.00×10⁵拷贝/反应~1拷贝/反应,ddPCR测得值的对数值与DNA浓度的对数值有线性关系。在疫情相关血液标本DNA的检测中,ddPCR阳性率远高于培养法和试管凝集法;16份人血液标本中靶标基因浓度为5~65拷贝/mL血液(平均29拷贝/mL血液),5份羊血液标本中靶标基因浓度为25~245拷贝/mL血液(平均98拷贝/mL血液)。结论 ddPCR灵敏性高,可检测微量核酸DNA,适合临床血液标本的检测以及布病病原体的分子流行病学调查。     

免疫磁分离-荧光PCR应用在肉类单增李斯特氏菌的检测

目的建立适用于肉类产品中单核增生李斯特氏菌的荧光PCR检测方法。方法根据单增李斯特氏菌溶血素基因hlyA,设计合成引物和荧光探针,结合免疫磁珠筛选,选择简便的DNA提取方法,建立适用于检测肉类制品中单增李斯特氏菌的荧光PCR方法。对该方法进行特异性、灵敏度及模拟样品检测效果的研究。结果对20株不同菌属的标准菌株和30株野生李斯特氏菌菌株,及混合菌液的检测,结果显示该方法具有良好的特异性。对染菌模拟样本的检测结果表明,经过24h增菌,该方法的检测低限为1cfu/g,整个流程只需27h。结论免疫磁分离荧光PCR方法为快速、简便和准确检测肉类制品中单增李斯氏菌提供了一个新的途径。     

应用免疫磁珠分离法及荧光定量PCR技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157：H7

目的建立免疫磁珠分离法（immunomagnetic separation,IMS）联合荧光定量PCR（real-time PCR）技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7的方法。方法根据肠出血性大肠埃希菌O157∶H7抗原特异性基因rfbEO157设计引物和荧光探针,建立real-time PCR检测体系,并检测其特异性及敏感性;用O157免疫磁珠特异性捕获标本菌液中的O157∶H7大肠埃希菌,结合real-time PCR对磁珠捕获菌细胞的DNA进行检测分析。结果 Real-time PCR检测结果显示,O157∶H7大肠埃希菌可产生荧光信号,而其他常见致病菌均未见明显荧光信号;采用IMS-real-time PCR方法检测标本,菌液含菌量为3.3×102CFU/mL时即可被检出,检测全过程需时约4h。结论 IMS-real-time PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、快速易操作等特点,该检测方法能提高O157∶H7大肠埃希菌的检出率和准确性,可用于标本的快速诊断、疾病监测和暴发疫情的病原学调查。     

SYBR GreenⅠ染料法定量PCR用于人体疟原虫定量检测及虫种鉴别的研究

目的建立一种可用于疟原虫检测并同时鉴别虫种的荧光定量PCR方法。方法根据人体疟原虫18SrRNA基因序列特征,在疟原虫种特异性区域两侧的属特异性保守区设计引物,对4种人体疟原虫进行PCR扩增,将得到的扩增产物采用TA克隆法插入pGEMT载体制备标准质粒,用于制备标准曲线进行定量分析,并进行熔解曲线分析,测定各虫种扩增产物的熔解温度。结果 4种人体疟原虫均能扩增得到特异性片断,荧光定量PCR方法中建立的标准曲线相关关系较好（相关系数r=-1.00）,熔解曲线分析结果显示,4种人体疟原虫的熔解温度相差较大,分别为三日疟原虫71.3℃、恶性疟原虫72.8℃、卵形疟原虫74.6℃和间日疟原虫75.8℃。结论建立的SYBR GreenI染料法荧光定量PCR技术可同时进行人体疟原虫的定量检测和虫种鉴别。     

Development of a One-Step SYBR Green I Real-Time RT-PCR Assay for the Detection and Quantitation of Araraquara and Rio Mamore Hantavirus

Hantaviruses are members of the family Bunyaviridae and are an emerging cause of disease worldwide with high lethality in the Americas. In Brazil, the diagnosis for hantaviruses is based on immunologic techniques associated with conventional RT-PCR. A novel one-step SYBR Green real-time RT-PCR was developed for the detection and quantitation of Araraquara hantavirus (ARAV) and Rio Mamore hantavirus (RIOMV). The detection limit of assay was 10copies/µL of RNA in vitro transcribed of segment S. The specificity of assay was evaluated by melting curve analysis, which showed that the Araraquara virus amplified product generated a melt peak at 80.83 ± 0.89 °C without generating primer-dimers or non-specific products. The assay was more sensitive than conventional RT-PCR and we detected two samples undetected by conventional RT-PCR. The one-step SYBR Green real-time quantitative RT-PCR is specific, sensible and reproducible, which makes it a powerful tool in both diagnostic applications and general research of ARAV and RIOMV and possibly other Brazilian hantaviruses.     

首次自褐家鼠粪便标本中检出香港海鸥菌

目的了解褐家鼠粪便标本中是否携带香港海鸥菌,并分析其耐药特征及分子分型。方法2015年6月-2016年5月,利用笼捕法于广州市南方医院及其周边居民区捕获褐家鼠,其粪便样本经增菌后接种改良头孢哌酮MacConkey琼脂(CMA)平板培养分离可疑菌株,经生化试验及16SrRNA测序确认。采用K-B法进行药物敏感性测定,并运用多位点序列分型进行分子分型分析。结果共捕获褐家鼠191只,并在2份褐家鼠粪便标本中检出香港海鸥菌,检出率为1.05%。两株菌16SrRNA的测序结果与香港海鸥菌标准株HKU1的一致性达100%。药敏试验显示两株分离株均对头孢菌素类抗生素及利福平耐药。多位点序列分型结果显示两株菌分别为2个新的ST型:ST-163和ST-164。结论褐家鼠粪便中存在香港海鸥菌污染。褐家鼠与人类生活关系密切,可能为人类感染的的另一潜在来源。     

贵州省3株钩端螺旋体分离株PFGE分型与基因种鉴定

目的应用脉冲场电泳（PFGE）分型技术和16S rRNA基因测序分析技术分别对贵州省3株动物宿主钩 端螺旋体分离菌株进行分子分型和基因种鉴定,了解贵州省钩端螺旋体的分子流行病学特征。方法应用 DNA限制性内切酶Not I对钩端螺旋体染色体DNA酶切后,用PFGE将DNA片段分离,采用BionumericsV4.0将3 株钩体菌株PFGE图谱与中国15群15型参考菌株进行聚类分析;同时,应用PCR扩增几乎全长的钩体16S rRNA基因片段,并将扩增产物进行双向序列测定,并与GenBank数据库已注册的核酸序列进行同源性比对 、确定基因种、分析亲缘进化关系。结果来自贵州省的3株动物宿主分离钩体菌株PFGE带型命名为LepNot I 002和LepNot I 003,经聚类分析,3株菌株与黄疸出血群黄疸出血型赖株的相似性大于95%。16S rRNA 基因测序和分析表明,3株贵州分离钩体菌株之间的同源性为100%,与致病性钩体问号钩端螺旋体种（L. interrogans）不同血清型参考菌株的同源性达100%。结论3株贵州动物分离钩体菌株经PFGE分型鉴定与黄 疸出血群赖型赖株的相似性大于95%,经16S rRNA基因测序分析鉴定为L. interrogans种,上述两种方法 对贵州省钩体分离菌株的鉴定结果一致,有助于贵州省钩端螺旋体病的主动监测、暴发调查和传染源追踪 。     

Novel real-time PCr for detection of Schistosoma japonicum in stool

Chemotherapy has been used on a large scale in countries where the blood fluke Schistosoma japonicum is endemic. This has led to a lower intensity of infections and consequently lower diagnostic values of commonly used diagnostic tests like serology and Kato-Katz stool smear. We designed a novel real-time PCR method for detection of S. japonicum in stool samples. Further, we evaluated different versions of an inexpensive, non-commercial extraction method, ROSE, as well as the commercial QIAamp DNA Stool Mini Kit. PCR primer sequences were designed targeting the mitochondrial NADH dehydrogenase I gene. Bovine serum albumin was added to the DNA extracts and SYBR Green was used for detection. The PCR method was evaluated with non-infected stool samples spiked with S. japonicum eggs. It demonstrated high sensitivity, even in samples containing a single egg. The two extraction methods were equally effective. The PCR was specific for S. japonicum when tested against other Schistosoma species, Trichuris trichiura, hookworm and Taenia sp. We conclude that this novel real-time PCR, in combination with either ROSE or QIAamp DNA Stool Mini Kit extraction, is a sensitive and specific tool for diagnosing S. japonicum in human stool samples.     

均匀设计法在实时定量PCR检测条件优化中的应用研究

目的探索均匀设计在优化实时定量PCR检测条件中的应用,确立心钠素基因实时定量的最佳条件。方法以乳鼠心肌细胞cDNA为模板,退火温度和引物浓度为影响因素,应用均匀设计法探索影响心钠素基因实时荧光定量PCR的扩增条件;量化不同实验条件下的扩增效果,在最优的扩增条件下建立ANP基因定量扩增的相对标准曲线,并检测扩增效率。结果通过均匀设计法的试验设计,用8个试验点,完成了对温度和引物浓度2因素8水平的实验条件优化,建立了ANP基因实时定量PCR检测的最佳组合,为退火温度59.2℃、引物终浓度200μM。结论均匀设计是一种简便易行、快速经济的实时定量PCR检测条件的优化方法。     

血清胱抑素C对肝硬化患者肾损伤的诊断效能研究

目的 探讨应用血清胱抑素C水平诊断肝硬化患者并发急性肾损伤（AKI）的临床价值。方法 2015年1月~2017年2月我院接受治疗的114例肝硬化患者,按照血清肌酐水平在48 h内≥25.5 μmol/L诊断,结果并发AKI患者62例【其中急性肾小管坏死（ATN)8例,肝肾综合症（HRS）16例和前性氮质血症(PRA)38例】,非AKI患者52例。采用增强免疫比浊法检测血清胱抑素C。结果 AKI组合并冠心病19例,糖尿病17例,高血压16例,显著高于非AKI组的12例、10例和11例（P<0.05）;AKI组血清胱抑素C水平为（2.4±0.2） mg/L,显著高于非AKI组的（0.9±0.1） mg/L,白蛋白为（28.3±4.8） g/L,显著低于非AKI组的（34.1±7.3） g/L（P<0.05）;尿素氮为（15.3±5.4） mmol/L,血小板计数为（73.1±11.3）×10⁹/L,总胆红素为（43.8±9.5） μmol/L,血肌酐为（127.6±23.5） μmol/L,与非AKI组的（6.4±3.3） mmol/L、（90.6±12.7）×10⁹/L、（23.6±6.4） μmol/L和（73.4±15.2） μmol/L比,差异显著（P<0.05）;ATN组血胱抑素C水平为（3.6±1.6） mg/L,血小板计数为（102.6±21.7）×10⁹/L,总胆红素为（73.2±16.8） μmol/L,血肌酐为（346.8±30.7） μmol/L,均显著高于HRS组或PRA组（P<0.05）;血清胱抑素C诊断AKI的准确度为92.1%,特异度为95.7%,显著高于血肌酐或尿素氮。结论 血胱抑素C水平检测可帮助早期诊断肝硬化患者并发AKI,或有利于临床早期处理。     

流产衣原体荧光定量PCR方法的建立及小鼠感染菌体载量测定

目的 建立荧光定量PCR (qPCR)对流产衣原体的检测方法。在流产衣原体灭活疫苗的生产中,代替具有主观判断影响的涂片染色疫苗效价检测方法。方法 根据流产衣原体富含半胱氨酸的胞质蛋白(envB)基因保守序列设计特异性引物,利用EnvB-PMD19T阳性质粒为参考标准品,优化了反应条件,进行了敏感性、特异性及重复性试验,检测了感染流产衣原体小鼠的菌体载量。结果 以重组质粒为标准品建立的标准曲线在1×10² copies/μL~1×10⁶ copies/μL内呈现良好的线性关系,扩增效率为97%。灵敏度试验表明,该检测方法的最低检出限低至10 copies/μL。组内、组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有良好的重复性和稳定性。消化道检测到的菌体载量高于腹腔注射的菌体载量。结论 本研究建立的方法能够有效的检测小鼠相应脏器的菌体含量,为流产衣原体灭活疫苗的效检提供可靠的检测方法。     

实时荧光RT-PCR检测凝血块中乙脑病毒RNA

目的探索建立灵敏便捷的乙脑病毒核酸检测方法,为临床疑似乙脑病例提供可靠辅助诊断依据。方法采用基于SYBR Green I染料的实时荧光RT-PCR方法,对一系列乙脑病毒检测引物进行综合评价,并应用于部分临床确诊或疑似乙脑病例血清和凝血块中病毒核酸检测。结果根据9对引物检测连续稀释病毒RNA的扩增曲线和融解曲线,筛选出1对灵敏度和特异性较好的引物。该体系分别检测15份乙脑病毒IgM阳性和15份IgM阴性患者的血清和凝血块中提取的核酸,血清样品全部为阴性,而凝血块样品发现7份核酸阳性。结论从患者凝血块中提取核酸样品,可以用于JEV感染的实验室诊断。在我们建立的乙脑病毒核酸实时荧光PCR检测体系中,首次发现凝血块样品比血清样品灵敏度更高,说明凝血块用于病毒性脑炎实验室诊断具有重要价值。