婴儿源益生性双歧杆菌的筛选及肠道定殖性研究

本研究旨在从婴儿粪便中筛选出具有潜在益生特性的双歧杆菌,并探究其肠道定殖情况,为双歧杆菌的产品开发提供优良的菌株。采用MRS培养基对样品进行分离纯化,菌株经F6PPK检测及16S r DNA测序鉴定,之后进行模拟胃肠液、胆盐耐受性、对食源性致病菌(大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌等)的抑制及对HT-29细胞的粘附能力测定,将筛选出的菌株进行动物实验,测定其肠道定殖能力。分离到的27株双歧杆菌,经分子生物学鉴定为7个不同的种:Bifidobacterium longum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium pseudocatenulatum、Bifidobacterium infantis、Bifidobacterium animalis和Bifidobacterium adolescentis。体外实验表明,B.longum A9、B.breve A4、B.bifidum B6、B.longum C6、B.adolescentis F8和B.infantis H6等具有较强的潜在益生特性;动物实验表明,B.infantis H6和B.longum C6具有较强的肠道定殖能力。B.longum C6和B.infantis H6有望作为优良的益生性菌株,应用于双歧杆菌的产品开发。     

新疆喀什地区维吾尔族婴幼儿肠道双歧杆菌遗传差异及益生特性分析

分析新疆喀什地区维吾尔族婴幼儿肠道双歧杆菌的遗传差异,以期为少数民族婴幼儿肠道益生双歧杆菌的开发奠定一定基础。本实验采用16S rRNA基因序列结合基因外重复回文序列聚合酶链式反应指纹分型技术,对菌株遗传结构差异进行分析,根据遗传指纹挑选部分代表性双歧杆菌,检测它们对常见6种致病菌的抑菌活性并对抑菌性能较好的菌株进行耐酸耐胆盐、碳源代谢及抗生素药敏实验。研究发现有75株为双歧杆菌,隶属于4个种及2个亚种,分别为Bifidobacterium bifidum、B. pseudocatenulatum、B. adolescentis、B. longum subsp. infantis和B. longum subsp. suis。抑菌实验结果表明,有16株双歧杆菌具有广谱抑菌性能;药敏实验显示这些菌株除对阿米卡星及万古霉素表现耐药外,对其他抗生素均表现敏感或中度敏感;耐酸耐胆盐实验表明抑菌菌株中B. longum subsp.infantis f65-26和B. pseudocatenulatum f115-8为耐受性最优菌株,具有潜在开发利用价值。     

成人粪便中长双歧杆菌长亚种的分离鉴定及多位点序列分型分析

为了对成人粪便中分离的长双歧杆菌长亚种进行多位点序列分型分析,采用改良MRS培养基从健康成人粪便中分离的长双歧杆菌长亚种,通过生理生化试验结合16S rDNA和热应激蛋白60(heat-shock protein,hsp60)同源性分析鉴定分离株,利用同源性分析及多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术进一步分析长双歧杆菌长亚种的基因多态性。从12个健康成人体内分离得到24株厌氧的细菌菌株,经形态学观察、生理生化试验、16S rDNA及hsp60同源性分析发现,其中14株分离株为长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp. longum)。MLST结果表明:14株长双歧杆菌长亚种可分为10种基因型,且均与Bifidobacterium longum subsp. longum ATCC 15707为不同基因型。健康成人粪便中分离的长双歧杆菌长亚种具有较大的基因多态性。     

牦牛酥油乳脂肪球膜蛋白分离纯化和蛋白组鉴定及功能分析

为探究牦牛酥油脂肪球膜(milk fat globule membrane, MFGM)蛋白纯化前后的组成及功能差异，通过表面活性剂聚乙二醇辛基苯基醚溶液和钠离子磷酸盐缓冲溶液提取牦牛酥油中MFGM蛋白，利用AKTA pure 25M蛋白质纯化系统结合阴离子交换层析柱DEAE-Sepharose FF(DEAE琼脂糖凝胶),对MFGM蛋白脂肪酸结合蛋白3(fatty acid binding protein 3,FABP 3)纯化工艺进行优化，得出最优条件：洗脱体积50 mL,缓冲液pH 7.4,洗脱速度1.6 mL/min,洗脱液浓度0.50 mol/L,该条件下，FABP 3得率达83.19%。以牦牛酥油MFGM蛋白粗提物和纯化物为研究对象，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和液相色谱质谱联用技术，结合无标记相对定量分析，得出主要MFGM蛋白为FABP 3,共定量到31种MFGM蛋白，其中纯化MFGM蛋白和粗提MFGM蛋白差异蛋白20种，并通过基因本体功能注释、KEGG代谢通路分析对鉴定到的蛋白进行功能及作用的生物学途径探讨。     

新疆喀什地区维吾尔族母乳源双歧杆菌分离筛选及其益生特性分析

采用多重聚合酶链式反应指纹图谱结合16S rRNA基因测序技术对新疆喀什地区维吾尔族母乳分离的双歧杆菌进行鉴定和遗传差异分析,并检测常规生理生化和糖代谢表型特征,同时测试菌株对6 种常见病原菌和3 种母乳源条件致病菌的抑菌性能和对胃肠液的耐受性。结果显示,15 份母乳样品中共分离15 株双歧杆菌,测序结果将菌株归属于3 个种以及2 个亚种,包括8 株假小链双歧杆菌（Bifidobacterium pseudocatenulatum）、2 株短双歧杆菌（B. breve）、2 株长双歧杆菌长亚种（B. longum subsp. longum）和3 株长双歧杆菌婴儿亚种（B. longum subsp. infantis）。抑菌实验表明,15 株测试菌株中,隶属于B. pseudocatenulatum的4 株菌MY92、MY75-1、MY72、MY81的抑菌谱更广,抑菌能力更强;胃肠液耐受性实验表明菌株MY92无论在模拟胃液还是模拟肠液中存活率均最高,分别达到20.37%和0.302%。基于以上描述特性,MY92作为一株有效的益生菌株,具有潜在的利用价值,为后期进一步作为防止婴幼儿腹泻辅助制剂的开发提供参考。     

富硒长双歧杆菌优势菌株的高通量选育

运用96孔深孔板微型化培养和酶标仪快速检测，建立富硒长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）优势菌株的高通量筛选方法。通过高通量筛选获得的富硒长双歧杆菌优势菌株XBL-30，具有很好的硒蛋白转化能力。在7 L罐中添加一定浓度的亚硒酸钠，优势菌株XBL-30的硒蛋白转化率从原始菌株的60%提高至85.3%，菌株多次传代后，硒蛋白转化率均能稳定在85%。该研究建立的高通量筛选方法不仅简单，快速，成本低，而且对其他微生物菌株的高通量筛选具有一定的参考价值。     

含金属硫蛋白鸡蛋水解物对两种乳酸菌体外生长的影响

以乳酸菌生长过程中的pH、OD值和菌落总数为评价指标,研究了普通鸡蛋、含金属硫蛋白鸡蛋、普通鸡蛋水解物以及含金属硫蛋白的鸡蛋水解物对动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌以及两种混合菌的影响。结果表明,鸡蛋水解物作为氮源能够促进乳酸菌的增殖,经比较,最佳氮源为含金属硫蛋白鸡蛋水解物,其动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和混合菌发酵液OD值为普通鸡蛋水解物的1.05倍、1.08倍和1.09倍。含金属硫蛋白的鸡蛋水解物在动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌以及两种混合菌发酵液的最佳添加量分别为2.0%、1.5%和2.0%,活菌数分别可达7.5×109、3.21×109和2.33×1010 CFU/mL。本研究为开发乳酸菌发酵金属硫蛋白鸡蛋肽产品提供指导。     

猴头菇多糖对胃肠道益生菌生长的影响

胃肠道益生菌群具有促进食物消化和营养吸收、改善肠道微生态平衡,增强机体免疫力等作用。为明确猴头菇多糖对胃肠道益生菌生长的影响,本研究通过在培养基中添加0.3%、0.5%、0.7%的猴头菇多糖,用平板菌落计数法检测保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)3种胃肠道益生菌的生长情况。接着通过体外模拟人胃和肠道环境试验,分析猴头菇多糖对这3种菌在胃肠道模拟环境中的生长影响。结果显示:与未添加猴头菇多糖的培养基相比,随着猴头菇多糖含量的增加,均能够显著促进保加利亚乳杆菌和青春双歧杆菌的生长(P<0.05),0.7%的猴头菇多糖添加量增殖效果最为明显;而随着猴头菇多糖含量逐渐增加,嗜热链球菌的生长量增速放缓,0.5%的猴头菇添加量即达到促进的最大值。7%的猴头菇多糖添加量能够显著增强保加利亚乳杆菌对胃液和肠液的耐受性(P<0.05),增强青春双歧杆菌对肠液的耐受性,显著增强嗜热链球菌对肠液的耐受性(P<0.05)。因此0.3%~0.5%的猴头菇多糖添加量可促进胃肠道益生菌的生长;7%的猴头菇多糖添加量可提高益生菌对胃肠道消化液的耐受力。     

新疆地区母乳中乳酸菌的分离鉴定及潜在益生菌的筛选

母乳是婴儿营养物质的主要来源且蕴藏着丰富的乳酸菌资源。为了了解新疆地区母乳中乳酸菌组成,筛选母乳中具有优良益生特性的双歧杆菌。该文通过传统纯培养方法对6份新疆地区母乳中的乳酸菌进行分离鉴定。以益生菌株Bifidobacterium lactis BB12作为对照,通过发酵特性、体外胃肠液耐受性及胆盐耐受性试验对双歧杆菌进行筛选,得到2株具有潜在益生特性的双歧杆菌,对其进行最适pH,最适温度,对NaCl的耐受性,生长曲线及菌株产酸能力等生理生化特性试验。从6份样品中共分离到69株乳酸菌,鉴定为7个属11个种及亚种,其中Streptococcus salivarius为优势菌,通过初步筛选获得2株具有潜在益生特性的双歧杆菌：Bifidobacterium longum IMAU99727和Bifidobacterium animalis subsp.lactis IMAU99728,有望作为新的母乳源益生菌进行其他益生特性研究和开发利用。     

无锡城乡年轻居民肠道菌群多样性研究

采用PCR和DGGE相结合的技术,研究了生活于无锡城市和乡村的青年志愿者肠道菌群的多样性。基于DGGE指纹图谱,使用聚类和PCA分析对志愿者肠道微生物相似性进行分析,使用Shannon-Weine多样性指数(H)、丰度(S)和均匀度(EH)对志愿者肠道微生物多样性进行分析,对图谱中具有代表性的共性和特异性条带进行胶回收和测序以分析志愿者肠道微生物组成;基于PCR技术在种水平上对城乡志愿者肠道内乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)多样性进行定性分析。结果显示,无锡城乡青年居民间肠道微生物群落结构存在分开趋势,相似性小于城市或乡村居民内部;多样性方面差异不显著;不动杆菌属、双歧杆菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、梭菌属和瘤胃球菌属为城乡青年居民肠道内的共有菌属;乳杆菌属Lactobacillus(L.)和双歧杆菌属Bifidobacterium(B.)各类菌群在城乡居民肠道内分布差异不显著,其中L.plantarum,L.casei,L.salivarius和L.acidophilus以及B.longum,B.breve,B.animalis和B.adolescentis分别为无锡青年居民肠道内的优势乳杆菌和双歧杆菌。综上分析,初步揭示了无锡城市和乡村青年居民肠道微生物多样性差异不显著。     

绿豆和乳清蛋白水解物对双歧杆菌促生长条件的研究

对婴儿双歧(Bifidobacterium infantis)和两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)的生长发育特性进行研究,在掌握双歧杆菌基本特性的基础上,以乳糖、乳清水解物和绿豆水解物为促生长因子,研究其对双歧杆菌的增殖影响.经过单因素和正交试验发现,乳清蛋白水解物和绿豆蛋白水解物对两种双歧杆菌都有显著的促生长作用.最佳培养基优化方案为:对婴儿双歧杆菌,在基础PTYG培养基基础上,添加1.5g/100mL的乳糖,40%的乳清蛋白水解物和40%的绿豆蛋白水解物;对两歧双歧杆菌,在基础PTYG培养基基础上添加0.5g/100mL的乳糖,40%的乳清蛋白水解物和40%的绿豆蛋白水解物.     

降胆固醇双歧杆菌BZ11的筛选及其耐受性评价

采用平板涂布法从贵州特色香猪粪便中筛选具有降胆固醇能力及耐酸、耐胆盐和耐氧性能的双歧杆菌（Bifidobacterium）。从香猪粪便中共筛选出19株具有双歧杆菌形态特征的菌株。采用邻苯二甲醛法测定其降胆固醇率,得到7株降胆固醇能力较高菌株,其中菌株BZ11降胆固醇率最高可达（38.52±0.60）%,并对酸、胆盐和氧具有较高的耐受性。经菌落形态特征、生理生化试验及16S rRNA序列分析,菌株BZ11被鉴定为动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）。     

新疆维吾尔族肠道中高产胞外多糖双歧杆菌的筛选及其抗氧化活性

使用Wilkins-Chalgren厌氧菌琼脂和BSM培养基作为筛选平板,结合重复基因外回文序列-聚合酶链式反应和16S rRNA序列分析,对新疆维吾尔族婴儿及其母亲粪便中的双歧杆菌(Bifidobacterium)进行分离鉴定,并筛选出高产胞外多糖的双歧杆菌,测定其多糖的抗氧化活性以及菌株的耐受性和黏附性。结果显示,20份粪便样品中共分离出52株双歧杆菌,其中假小链双歧杆菌(B. pseudocatenulatum)14株,假长双歧杆菌(B. pseudolongum)8株,两歧双歧杆菌(B.bifidum)9株,短双歧杆菌(B.breve)7株,长双歧杆菌婴儿亚种(B.longumsubsp.infantis)5株,动物双歧杆菌乳亚种(B. animal subsp. lactis)6株以及长双歧杆菌(B. longum)3株。经过表型初筛和苯酚-硫酸法复筛,共筛选出7株高产胞外多糖的双歧杆菌,37℃发酵36 h后胞外多糖产量均可达400 mg/L以上。抗氧化活性实验结果表明7株双歧杆菌所产的胞外多糖对过氧化氢自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基均有一定的清除能力。此外,菌株BF66-16相较于其他几株双歧杆菌具有较强的胃肠液耐受性以及黏附性,因此来源于婴儿粪便的BF66-16可以作为潜在的抗氧化菌株应用于制药和食品工业中。     

适于脱脂羊奶益生菌发酵剂发酵条件的优化

以干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)为试验菌种,对脱脂羊奶为发酵基质的益生菌发酵条件进行研究。通过单菌发酵和复配菌种发酵试验,筛选出最佳的益生菌复配组合。在单因素试验的基础上,通过正交试验优化复配益生菌的最佳发酵条件。结果表明:最佳益生菌复配组合为干酪乳杆菌(L. casei)和长双歧杆菌(B. longum),接种比例为3∶1,接种量为4%,发酵温度为37℃,发酵时间为54 h。在此优化条件下,发酵基质中的最大活菌数为9.59×10~8 CFU/m L,滴定酸度达到198.56°T。     

健康成人粪便中双歧杆菌的分离鉴定及其发酵乳体内特性研究

为筛选具有潜在益生功能的双歧杆菌,采用MRS培养基,结合菌落形态观察和16S rDNA基因序列同源性分析,从上海地区健康的成人粪便中分离鉴定双歧杆菌,通过7 L发酵罐发酵试验筛选优良菌株,并利用其制备发酵乳,对发酵乳的体内特性进行研究。结果表明,分离并鉴定到3株长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）（编号为P-1、P-2和P-3）,其中菌株P-2制备的发酵乳在稳定期活菌数最高,遗传稳定性好,被确定为优良菌株,并被命名为DD98。菌株DD98制备的发酵乳能显著增加小鼠胃肠道内有益菌、减少有害菌的表达（P＜0.05）,具有调节肠道菌群的作用。此外,能维持小鼠正常的体质量、血常规指数,有利于小鼠脏器的生长。     

动物双歧杆菌乳亚种HCS04-002发酵条件优化

为实现动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HCS04-002的高活菌数培养,获得其生长的最适发酵条件,对发酵工艺和发酵培养基分别进行优化。以菌泥收率为考察指标,通过单因素及正交试验对培养温度、接种量和初始pH值等发酵工艺参数进行了优化;以发酵液活菌数为响应值,通过单因素试验和Box-Behnken试验优化发酵培养基。结果表明,动物双歧杆菌乳亚种HCS04-002最佳发酵条件为：培养温度39 ℃、接种量3%、初始pH值为7.2;最佳发酵培养基组分为：酵母蛋白胨24 g/L、酵母浸出物30 g/L、葡萄糖19 g/L、乳糖11 g/L。在此优化条件下,菌株HCS04-002菌悬液活菌数达2.73×109 CFU/mL。     

产蛋白酶菌株的鉴定及其对虾壳的脱蛋白研究

从虾塘沉积物中分离到一株产蛋白酶的菌株C1,采用菌落形态、生理生化特征和16S rDNA基因序列分析相结合的方法进行鉴定,进一步探究其在提取虾壳甲壳素工艺中脱蛋白的应用,并与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）对虾壳蛋白脱除效果进行比较分析。结果表明,菌株C1被鉴定为一株蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）,其对虾壳的脱蛋白能力高于枯草芽孢杆菌。当发酵培养基中葡萄糖添加量为50 g/L,虾壳粉添加量为20 g/L,酵母膏添加量为1 g/L时,枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌发酵5 d的蛋白酶活力分别为145.7 U/mL、220.8 U/mL,脱蛋白率分别达到80.4%、90.8%。     

不同来源食品级乳酸菌及双歧杆菌对乳酸链球菌素敏感性的研究

目的:研究不同来源的食品级乳酸菌和双歧杆菌对乳酸链球菌素(nisin)的敏感性,为构建以nisin作为食品级筛选标记的受体乳酸菌表达系统以及筛选食品发酵、保鲜与贮藏过程中的nisin抗性乳酸菌提供科学依据.方法:采用试管稀释法研究不同来源的食品级的18株乳酸球菌、15株乳酸杆菌和5株双歧杆菌对nisin的敏感性.结果:大部分乳球菌和部分乳杆菌对nisin不敏感,但乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)ML0230、99210,肠膜明串珠菌葡聚糖亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp dextranicum)AS 1.2141T,嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)La1,德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus)S-1、DR、LD、AS 1.2625T,长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)Blm对nisin非常敏感.在nisin质量浓度为5 μg/mL(IU/mL)时即可抑制其生长.结论:初步筛选出17株以nisin作为食品级筛选标记的受体乳酸菌,同时筛选出21株食品发酵、保鲜与贮藏过程中的nisin抗性乳酸菌.     

两歧双歧杆菌促生长培养基的初步筛选

本试验首先比较了两歧双歧杆菌在TPY,PTYG和改良MRS培养基的生长情况,发现PTYG作为两歧双歧杆菌的生长培养基相对较好;然后在PTYG培养基中加入乳清蛋白水解液和乳糖,结果表明乳清蛋白水解液与乳糖对两歧双歧杆菌的生长有一定的影响,其适当添加量为10%乳清蛋白水解液（mL/mL）和1.5%乳糖（g/g）。     

白酒大曲中一株散囊菌的鉴定及培养条件优化

以分离自扳倒井中高温大曲中的一株散囊菌（Eurotium）CICC 41584为研究对象,经菌落形态观察、理化特征试验以及分子生物学研究对菌株CICC 41584进行鉴定。在基础生长培养基上,通过单因素试验、Plackett-Burman及Box-Behnken试验对菌株CICC 41584培养条件进行优化。结果表明,菌株CICC 41584被鉴定为谢瓦散囊菌（Eurotium chevalieri）,该菌株最佳培养条件为蔗糖添加量40 g/L,酵母浸粉添加量27.2 g/L,硫酸镁添加量2.6 g/L,培养温度28 ℃,培养时间10 d,转速120 r/min,接种量2%,装液量50 mL/250 mL。在此优化条件下,菌丝干质量达到1.95 g/100 mL,较优化前提高了8.29倍。