肿瘤坏死因子基因转导肿瘤浸润淋巴细胞的初步研究及应用

用单纯疤疹病毒(HSV)的缺陷株作为载体,感染肿瘤细胞治疗脑瘤的研究已取得了不少进展.本文报道将HSV—tk基因转移联合抗瘤药物GCV可使荷脑瘤大鼠长期存活.9L神经纤维肉瘤细胞用HSV载体hrR3转染,hrR3缺乏RNA还原酶,只能在肿瘤细胞中复制而不能在神经细胞中复制存活,同时还携带病毒胸苷激酶(tk)基因,RH105无tk基因,转染hrR3的9L细胞体外培养,加入GCV1μg/ml共孵育,结果发现9L细胞被杀死的数目比单纯感染hrR3的细胞死亡数目增加23%.GCV加到不表达tk基因的RH105载体转染的9L细胞体系中没有杀伤作用.将神经纤维肉瘤9L细胞4×10~4接种到Fischer 344CD大鼠脑前叶,5天后将hrR3载体2×10~7PFU/10μl直接定位注射至脑瘤部位.结果发现hrR3载体治疗可使20%的大鼠存活时间超过5个月,而生理盐水组全部死亡.接种病毒后同时用GCV7.5mg/kg治疗7天,可使48%的荷9T肿瘤细胞的大鼠存活时间超过5个月PH105感染的治疗组大鼠全部死亡,组织化学检查证明外源性的tk基因在肿瘤细     

HSV-tkGCV系统联合重组人TNF-α治疗脑胶质瘤的离体实验研究

 目的　探讨HSV tk GCV系统联合rhTNF α抗脑胶质瘤的有效性。方法　利用重组HSV tk逆转录病毒载体转染大鼠C6细胞得到HSV tk阳性细胞 ,C6 GCV、C6+tk GCV、C6+rhTNF α和C6+tk GCV +rhTNF α4组在体外分别给予GCV或 和rhTNF α处理 ,用MTT法测量细胞存活率 ,比较各组肿瘤细胞存活率。卡方检验作显著性检测。结果　未加任何抗癌因子处理的C6细胞组肿瘤细胞生长旺盛 ,细胞形态无明显改变 ;各处理组的肿瘤细胞 2～ 3天后开始逐渐出现细胞突触消失 ,细胞变圆 ,胞体皱缩 ,核仁固缩、裂解、甚至消失 ,继而逐渐死亡。联合应用HSV tk GCV +rhTN α组的肿瘤细胞存活率比单纯应用HSV tk GCV组或rhTNF α组明显低 (P <0 0 5)。结论 :联合应用HSV tk GCV系统和rhTNF α的杀癌细胞效果优于单一使用HSV tk GCV系统或者rhTNF α。     

涎腺多形性腺瘤的倍体分布及与基因治疗的关系

目的:探讨涎腺多形性腺瘤的DNA含量及倍体分布与HSV-tk基因治疗的关系.方法:采用流式细胞仪测定50例涎腺良性多形性腺瘤DNA含量和倍体分布并结合临床资料进行分析;应用腺病毒介导的HSV-tk基因分别转染培养中良性及交界性多形性腺瘤细胞;RT-PCR方法检测基因表达;四唑蓝比色(MTI)法测定HSV-tk系统对二倍体及异倍体肿瘤细胞的杀伤作用.结果:10例正常涎腺组织皆为二倍体;涎腺良性多形性腺瘤异倍体率20.0%;30岁以下年龄,病程在2年以内及瘤体直径＞5cm者异倍体率明显增高(P＜0.05).二倍体肿瘤细胞转染HSV-tk/GCV基因后3、5天,细胞存活率分别为78.3%和37.7%.异倍体肿瘤细胞转染HSV-tk/GCV基因后3、5天,细胞存活率分别为27.6%和27.2%,二者细胞存活率有显著性差异(P＜0.05).结论:1)涎腺多形性腺瘤异倍体检出率与患者的年龄,病程及瘤体直径有密切关系;2)HSV-tk/GCV在治疗后的3、5天对异倍体肿瘤细胞杀伤作用明显高于二倍体肿瘤.     

HSV_1-TK转染人肺腺癌细胞A549的实验研究

目的　体内外观察HSV1 TK/GCV对人肺腺癌细胞A5 49的杀伤效应。方法　构建含TK基因的逆转录病毒表达载体 ,电穿孔法转化肺癌细胞A5 49。MTT法检测转染细胞对GCV的药物敏感性 ,并观察旁观者效应 ;电镜、FCM、TUNEL法检测GCV诱导转染细胞凋亡变化 ;PCR和细胞原位杂交分别检测转染细胞TK基因整合和表达 ;活体内观察GCV对转染细胞、亲代细胞接种裸鼠皮下肿瘤治疗效果。结果　转基因细胞变得较不规则 ,多角型 ,易形成空泡。A5 49、A5 49 PLXSN、A5 49 TK三种细胞体外倍增时间分别为 ( 3 6.15± 3 .2 7)、( 4 0 .82± 3 .75 )和 ( 4 2 .0 6± 4.12 )小时 (P >0 .0 5 )。转染细胞对GCV的敏感性比亲代细胞提高 46倍 (P<0 .0 0 1)。旁观者效应在高细胞密度接种 ( 1× 10 4细胞 /孔 )较低细胞密度接种 ( 1× 10 3细胞 /孔 )明显。电镜发现转染细胞有凋亡小体、核呈半月征。FCM、TUNEL均能检测到转染细胞凋亡发生率明显高于对照细胞 (P<0 .0 0 1)。PCR及原位杂交表明转染细胞有TK基因整合和表达。体内实验表明GCV能明显抑制转染细胞接种的肿瘤 ,而亲代细胞接种的肿瘤未受抑制。结论　转TK基因细胞在体内外都获得了对GCV的敏感性。TK/GCV系统杀灭肿瘤可能与诱导细胞凋亡有关。GCV能在活体内抑制转TK基因细胞裸鼠移     

单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因转染骨髓基质干细胞治疗大鼠脑胶质瘤

目的研究转染单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)基因的骨髓基质干细胞(BMSCs)对大鼠脑胶质瘤的治疗作用。方法原代培养BMSCs,AdCMV-tk转染BMSCs。逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测BMSCs/tk对tk基因的转录。以BrdU标记BMSCs/tk,观察其趋瘤性。四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测其对C6细胞的旁观者效应。将BMSCs/tk注入脑胶质瘤大鼠肿瘤对侧脑组织,原位末端标记(TUNEL)法检测脑内肿瘤细胞凋亡,动态MRI监测肿瘤体积的变化,观察荷瘤鼠生存期。结果全骨髓细胞培养法可获得纯化的BMSCs。感染AdCMV-tk 21 d后,BMSCs仍有明显的tk基因表达。转染tk基因后的BMSCs仍具有明显的趋瘤性。BMSCs/tk不仅在体外可产生明显的旁观者效应,在荷瘤鼠脑内也显示了明显的诱导肿瘤细胞凋亡的旁观者效应,凋亡阳性率为20.38%±2.57%,与BMSCs组(2.56%±0.52%)和对照组(2.74%±0.38%)相比,差异均有统计学意义(P值分别为0.023和0.025)。BMSCs/tk移植3周时,BMSCs/tk组、BMSCs组和对照组肿瘤体积分别为(8.28±2.64)、(134.51±16.37)和(147.22±31.05)mm3,BMSCs/tk组远小于BMSCs组(P=0.001)和对照组(P<0.01),并且部分大鼠脑内肿瘤消失。BMSCs/tk组大鼠生存期为(52.60±13.11)d,与对照组相比明显延长(P=0.01)。结论HSV-tk转染的BMSCs可能成为脑胶质瘤治疗的有效手段。     

pGL3-hTERT-tk/GCV对胃癌细胞的促凋亡作用

目的:探讨重组质粒pGL3hTERTtk/GCV对胃癌细胞的促调亡作用。方法：以基因工程方法构建重组质粒pGL3hTERTtk和相应的荧光报告质粒pGL3hTERTtkLuc+;脂质体LipofectamineTM2000瞬时转染胃癌细胞系SGC7901并用GCV干预,荧光显微镜观察细胞形态变化和转染效率,TUNEL标记和流式细胞术观察转染后胃癌细胞的凋亡;以上实验均以正常肝细胞L02为对照。结果：经鉴定,重组质粒pGL3hTERTtk中tk片段的长度为1 100 bp。荧光素酶标记的阳性、阴性对照及治疗报告质粒pGL3hTERTtkLuc+均能有效转染高表达端粒酶活性的胃癌细胞SGC7901,转染效率为(8.2±114)%。重组质粒转染胃癌细胞后与GCV共育4 d,细胞的凋亡率为(60.0±1.56)%;被pGL3hTERTtk转染的肿瘤细胞细胞周期发生了变化,处于细胞周期早期的细胞大量凋亡,早期凋亡率为（47.1±1.35）%。〖HT5W〗结论：〖HT5"SS〗pGL3hTERTtk/GCV对胃癌细胞有强烈的杀伤作用,但不影响正常细胞的生长,有潜在临床应用前景。     

HSV-tk基因转染过程对小鼠脾脏T细胞功能的影响

目的 :观察 HSV- tk基因转染过程对小鼠脾脏 T细胞增生、细胞毒效应和诱导移植物抗宿主病 (GVHD)能力的影响 ,为建立 HSV- tk/GCV系统治疗小鼠 GVHD模型作准备。方法 :将HSV- tk基因转染小鼠脾脏 T细胞 ,以未转染 T细胞作对照 ,比较两者增生能力 ;51 Cr释放试验测定TK+ T细胞和 T细胞的细胞毒效应 ;1× 1 0 6 雄性供鼠骨髓单个核细胞分别与 1× 1 0 7TK+ T细胞和 1× 1 0 7T细胞移植半相合雌性 Fl受鼠 ,观察两者诱导 GVHD的功能。结果 :TK+ T细胞和 T细胞增生能力和细胞毒效应无明显差异 ,诱导急性 GVHD能力相似。结论 :HSV- tk基因转染对小鼠脾脏 T细胞功能无明显影响     

hTERT基因启动子调控HSV-tk/GCV系统对HepG2细胞杀伤作用的实验研究

目的:研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦(HSV-tk/GCV)系统对肝癌细胞体外杀伤作用.方法:以pGL3-hT-ERT/tk为基础,构建pGL3-hTERT/lue、pGL3-basie/tk、pGL3-control/tk等真核表达载体,分别将其用脂质体法转染HepG2肝癌细胞和正常肝细胞L02,荧光显微镜观察转染效果,给予前药GCV,用原位末端标记(TUNEL)法、流式细胞仪检测hTERT调控的HSV-tk/GCV系统对两种细胞的杀伤作用,Western blot检测细胞周期素Cyclin D1、CDK2、p21蛋白表达.结果:hTERT启动子调控的HSV-tk/GCV系统对肝癌细胞有明显的杀伤作用,使41.85%的细胞凋亡;而对正常细胞作用不明显,Western也显示Cyclin D1、CDK2蛋白表达下降而p21升高.结论:hTERT启动子调控的tk基因治疗是一种具有肿瘤特异性的治疗方法,有望解决肿瘤基因治疗中的特异性杀伤及降低毒副反应等问题.     

EB病毒LMP1通过NF-kB介导的HSV-tk/GCV治疗EBV相关肿瘤的研究

目的:研究EB病毒潜伏膜蛋白1(EBV-LMP1)通过活化NF-kB反式激活HIV-LTR进而启动自杀基困HSV-tk在EBV相关肿瘤治疗中的作用,为进一步开展肿瘤治疗提供科学的实验依据。方法:以鼻咽癌细胞为实验模型,将HSV-tk基因置于HIV-LTR调控序列之下,构建LMP1调控且依赖于NF-kB的HSV-tk/GCV系统,采用同位素方法检测tk活性来研究LMP1通过NF-kB调控HSV-tk转录的靶向性和表达特征,MTT方法检测在GCV处理下肿瘤细胞的生长状况。结果:成功构建受LMP1调控且依赖于NF-kB的HSV-tk表达质粒,发现其在GCV处理下,表达LMP1的肿瘤细胞的生长有显著的抑制。结论;携带有LMP1-HSV-tk的细胞对GCV治疗高度敏感,显示这一肿瘤治疗系统在EBV相关肿瘤中具有一定的应用前景。     

双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统构建及体外效应研究

目的 构建高靶向性基因转移及基因表达系统,并研究其介导HSV-tk/GCV自杀基因系统对人肝癌细胞的体外杀伤作用。 方法 通过重组DNA技术分别构建anti-TfR ScFv-GAL4融合蛋白表达载体ScFv-GAL4-pET28a及含AFP启动子、GAL4特异性识别序列(GAL4rec)的HSV-tk真核表达载体pEBAF/tk-GAL4rec。前者经IPTG诱导表达获取anti-TfR ScFv-GAL4融合蛋白作为非病毒转运载体,利用受体介导内吞作用介导pEBAF/tk-GAL4rec质粒转染表面均高表达TfR的人肝癌细胞株HepG2、SMMC7721及人肺癌细胞株A549,潮霉素筛选阳性细胞,扩大培养,分别命名为HepG2/tk、SMMC7721/tk及A549/tk,然后通过MTT法检测GCV对它们的杀伤作用。 结果 双酶切鉴定及SDS-PAGE电泳证明非病毒转移载体anti-TfR ScFv-GALA融合蛋白及重组pEBAF/tk-GAL4rec真核表达质粒构建成功。体外杀伤实验中,表面TfR阳性且高分泌AFP(845 ng/ml)的HepG2/tk细胞对GCV很敏感,且抑制率与GCV浓度及作用时间呈正相关;而低分泌AFP(2ng/ml)的SMMC7721/tk细胞对GCV低度敏感;表面TfR阳性但不分泌AFP的A549/tk细胞则对前药不敏感。 结论 双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统构建成功,并显示出很好的靶向性。     

EB病毒LMP1通过NF-κB介导的HSV-tk/GCV治疗EBV相关肿瘤的研究

目的：研究EB病毒潜伏膜蛋白I(EBV-LMPl)通过活化NF-κB反式激活HIV-LTR进而启动自杀基因HSV-tk在EBV相关肿瘤治疗中的作用，为进一步开展肿瘤治疗提供科学的实验依据。方法：以鼻咽癌细胞为实验模型，将HSV-tk基因置于HIV-LTR调控序列之下，构建LMPl调控且依赖于NF-κB的HSV-tk/GCV系统，采用同位素方法检测tk活性来研究LMPl通过NF-κB调控HSV-tk转录的靶向性和表达特征，MTT方法检测在GCV处理下肿瘤细胞的生长状况。结果：成功构建受LMPl调控且依赖于NF-κB的HSV-tk表达质粒，发现其在GCV处理下，表达LMPl的肿瘤细胞的生长有显著的抑制。结论：携带有LMPl-HSV-tk细胞对GCV治疗高度敏感，显示这一肿瘤治疗系统在EBV相关肿瘤中具有一定的应用前景。     

腺病毒介导的KDR启动子-胸苷激酶系统对血管内皮细胞的选择性杀伤作用

目的研究腺病毒介导的KDR启动子-胸苷激酶系统对血管内皮细胞的选择性杀伤作用.方法应用PCR克隆出人KDR基因启动子序列-225 bp～+127 bp,以AdEasy system为载体,构建携带受KDR启动子或CMV启动子调控tk基因表达的2种重组腺病毒质粒pAdKDR-tk和pAdCMV-tk,在293细胞中包装、扩增后,体外感染表达KDR的脐静脉血管内皮细胞系HUVEC和不表达KDR的肝癌细胞系HepG2,并给予不同浓度的丙氧鸟苷(GCV)处理,5 d后收集存活细胞并计数.结果产生的病毒滴度均为5×109pfu/ml.在MOI为100、GCV为50μg/ml条件下,AdKDR-tk转染HUVEC后细胞生存率下降(31.49%±6.42%),AdKDR-tk转染HepG2后细胞生存率为76.57%±3.49%,而转染AdCMV-tk的2细胞系生存率均显著下降,细胞生存率分别为22.24%±3.77%(HUVEC)和26.53%±6.84%(HepG2).结论KDR基因启动子可调控HSV-tk在血管内皮细胞中特异性表达,为进一步开展靶向肿瘤血管内皮的自杀基因治疗研究奠定了基础.     

树突状细胞联合自杀基因tk及其效应的研究

树突状细胞研究热潮的掀起,源于发现了强大的抗原递呈功能.其抗瘤的思路,旨在补偿肿瘤逃逸机制中缺失的抗原信号和共刺激因子,体外扩增方法的成熟已展现了它良好的应用前景.HSV-tk/GCV系统基因疗法的关键,在于它直接杀伤或通过旁观者效应杀伤的肿瘤细胞,能使机体产生肿瘤特异性免疫.将树突状细胞与MCF-7/tk瘤苗联合应用,是集免疫和基因疗法优势的综合抗癌途径.本课题依据树突状细胞在抗原摄取、递呈上的特性,结合HSV-tk/GCV系统的旁观者效应能产生凋亡的特点,将两者联合应用,目的在于使其既能发挥自杀基因的瘤苗“接种作用”,又能使DC吞噬凋亡小体后进一步激发T细胞增殖,诱导特异性CTL生成.     

细胞之间介质传导的pCEAcd-tk/前药体系的旁观者效应

目的 :探讨融合自杀基因 pCEAcd tk/前药体系的旁观者效应的机理。 方法 :质粒 pCEAcd tk提取后 ,脂质体介导的方法转染到SPCA 1细胞中 ,与未转染的SPCA 1细胞混合 (2∶8)后接种到 96孔培养板中 (每孔 3× 10 3 ) ,加前体药物 5 氟胞嘧啶 [5 Fluorocytesine ,5 FC(5 μmol/L) ]和 [丙氧鸟苷 (Ganciclovir ,GCV(10 μmol/L) ],培养 5天 ,MTT法测定细胞存活率而观察旁观者效应。利用细胞种植密度的稀密和取转导了 pCEAcd tk融合基因的SPCA 1细胞 (处理细胞 )加前体药物的培养液和细胞裂解液对未转染细胞SPCA 1的毒性探讨旁观者效应的传递方式。结果 :融合基因pCEAcd tk/前药体系的旁观者效应在细胞密度较低时更明显 ,处理细胞的细胞培养液具有细胞毒性。结论 :融合自杀基因 pCEAcd tk/前药体系的旁观者效应的传递方式之一是通过细胞之间的某些介质传递。     

HSV-tk/GFP转基因系统的建立及转染细胞系的初步研究

HSV-tk/GCV是疾病基因治疗中常用的“自杀基因”系统.体内外的实验结果均表明:经HSV-tk转导的细胞对无毒原药丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)高度敏感,并被特异杀伤.该系统不仅可用于肿瘤基因治疗以特异杀伤肿瘤细胞,而且可在骨髓移植后选择性地清除HSV-tk转导阳性的异基因骨髓,从而降低GVHD的发生,避免由GMHD引发的一系列严重后果.能否控制GVHD,获得一定数量的HSV-tk转导阳性的骨髓细胞也很关键.由于转染效率的限制,必须经过筛选才能获得足够量的转导阳性细胞.以往采用新霉素抗性或潮霉素抗性基因进行筛选,通常需2～3周,细胞在体外长时间培养不仅浪费人力物力,而且增加了污染机会.我们采用     

转染HSV-tk骨髓基质干细胞旁观者效应机制的研究

目的:研究转染单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)基因的骨髓基质干细胞(BMSCs)旁观者效应的机制。方法:培养BMSCs,扩增Ad-CMV-tk后转染骨髓基质干细胞(BMSCs/tk);应用Transwell培养板使BMSCs/tk与C6细胞不相互接触,观察旁观者效应;观察0.22μm滤膜过滤后的条件培养液对C6细胞的作用。建立大鼠脑荷瘤模型,移植BMSCs/tk后,测定其血清中IFN-γ的变化;免疫组化观察荷瘤大鼠肿瘤内部淋巴细胞浸润及微血管密度。结果:在混合培养实验中,BMSCs/HSV-tk诱导BM-SCs的凋亡率明显高于对C6的凋亡率,两者差异有统计学意义,q=8.214,P=0.032。应用Transwell培养板培养后,BMSCs/HSV-tk诱导BMSCs凋亡率明显降低。BMSCs/HSV-tk/G-CV培养上清液可明显诱导C6细胞凋亡,但将其用0.22μm的滤膜过滤后,诱导凋亡的作用消失。脑荷瘤大鼠移植BMSCs/HSV-tk后血清IFN-γ浓度明显增高,肿瘤组织内CD4 细胞数、CD8 细胞数明显增加,微血管密度降低。结论:BMSCs/HSV-tk通过诱导BMSCs细胞凋亡后释放的凋亡小体介导旁观者效应,并发挥免疫学调节机制,对C6细胞可产生明显的抑制作用。     

腺病毒介导的IL—2基因及B7—1基因联合转染G422细胞致瘤原性和免疫原性的变化

目的研究联合细胞因子基因转染的D422胶质母细胞瘤细胞体内致瘤原性和免疫原性的变化,为胶质瘤的免疫基因治疗打下基础.方法IL-2基因和B7-1基因转染的G422细胞1×105皮下和脑内接种,观察肿瘤生长速度和荷瘤小鼠的存活期,2周取脾脏,检测NK、LAK和CTL的杀伤活性.结果IL-2和B7-1基因联合转染的G422细胞,皮下接种后肿瘤生长明显减慢,脑内接种动物存活期明显延长,NK、LAK和CTL的杀伤活性增强.结论IL-2基因和B7-1基因联合转染的G422细胞,致瘤原性下降,免疫原性增强,能有效激活机体特异性与非特异性抗肿瘤免疫反应.     

HSV-tk/GCV系统对小鼠肝癌细胞体外杀伤效应的研究

目的:研究HSV-tk/GCV系统对小鼠肝癌细胞的体外杀伤作用.方法:利用重组DNA技术,将HSV-tk基因亚克隆至逆转录病毒载体(pLNCTK)中,在LipofectAMINE介导下,转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NTH3T3细胞测定病毒滴度,将重组逆转录病毒感染小鼠肝癌细胞MM45T.Li,G418筛选,直至出现抗性克隆,挑取阳性克隆,扩大培养,命名为MM45T.Li/TK.PCR,RT-PCR对HSV-tk基因修饰的MM45T.Li细胞进行鉴定,然后观察CCV对MM45T.Li/TK和不同比例TK~ 与TK~-混合细胞的杀伤作用.结果:重组逆转录病毒滴度为5×10~5CFU/ml,PCR及RT-PCR分析证明HSV-tk基因已整合至MM45T.Li细胞基因组中,并在mRNA水平上的表达.MM45T.Li/TK与未转基因的原肿瘤细胞,二者的生长速度与形态结构无明显差别.MM45T.Li/TK细胞对CCV高度敏感,即低浓度GCV(1mg/L)处理MM45T.Li/TK细胞3d,即可将其杀死.旁观者效应显示将25%MM45T.Li/TK细胞与75%MM45T.Li混合,发现90%以上的细胞被杀死.结论:小鼠肝癌细胞对HSV-tk/CCV系统高度敏感,并具有明显的旁观者效应.