应用抑制消减杂交技术构建肝癌差异表达基因消减cDNA文库

目的 构建肝癌及癌旁肝细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法 采用新近建立的抑制消减杂交方法,以肝癌组织及癌旁肝组织作为对比材料,分离肝癌组织中差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T／A连接构建文库,将连接产物用电穿孔法转化大肠杆菌进行文库扩半后,随机挑取100个白色克隆及菌落PCR进行鉴定。结果 扩增消减cDNA文库获得3000余个白色阳性克隆,随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增,95％的克隆中均有100－600bp的插入片段,这些片段可能是肝癌差异表达基因的cDNA片段。结论 用SSH法及T／A克隆技术成功构建了肝癌与癌旁肝组织差异表达基因消减cDNA文库,该消减cDNA文库的建立为进一步筛选,克隆肝癌差异表达的新基因奠定了基础。     

抑制性消减杂交法构建甲状腺癌差异表达基因文库

目的：筛选并克隆在甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的基因。方法：(1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差示表达分析,构建人甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的cDNA消减文库;(2)克隆、鉴定甲状腺癌组织特异性高／低表达的基因;(3)登录Genbank,运用Blastn程序进行同源性分析。结果：成功构建了高消减效率的人甲状腺癌cDNA消减文库,对其中数个克隆的插入cDNA片段进行测序,经检索Genbank表明,正向SSH产物中有3个片段与来源于结肠上皮腺癌和Lung Epidermoid carcinoma的EST有100％同源性,提示它们来自恶性肿瘤相关基因。反向SSH产物中有5个片段为未知新序列,提示它们可能来自于在甲状腺癌中特异性低表达的新基因。结论：通过抑制性消减杂交技术,构建了人甲状腺癌cDNA消减文库,为下一步筛选鉴定甲状腺癌特异性基因及其全长克隆、功能研究等工作打下了基础。     

1个新的胰腺癌相关基因的筛选和初步鉴定

目的 筛选和鉴定胰腺癌相关基因.方法 提取胰腺癌和癌旁正常胰腺组织中的RNA和mRNA,应用抑制消减杂交技术(SSH)构建消减cDNA文库.采用随机数字表法挑选有插入片段的阳性克隆进行测序及同源性分析.应用RT-PCR和Northern blot检测新基因在12例胰腺癌和癌旁正常胰腺组织以及4种胰腺癌细胞株(PaTu8988、SW1990、BxPC-3、AsPC-1)中的表达情况.结果 随机挑取50个直径＞1 mm的白色克隆进行PCR扩增分析,其中47个克隆有插入片段,克隆阳性率为94%.对47个有插入片段的阳性克隆进行测序, 得到42个可用序列.同源性分析发现41个为已知基因,1个为无任何功能线索的未知基因,可能代表了新基因.RT-PCR显示新基因在12例胰腺癌组织和4种胰腺癌细胞株中均表达,而在正常胰腺组织中未见表达.Northern blot分析得到相同的结果.结论 应用SSH技术成功构建了人胰腺癌抑制消减cDNA文库,并筛选出1条新的胰腺癌相关基因.新基因与胰腺癌的发生、发展密切相关,可作为胰腺癌诊断和基因治疗的分子靶标.     

应用显微切割-cDNA PCR-SSH法克隆胃癌前病变相关基因

目的 构建胃异型增生组织cDNA消减文库,初步筛选差异表达基因。方法 手工显微切割取胃异型增生和正常组织,应用cDNAPCR方法对少量组织全转录组扩增后进行双向抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH),消减后片段与载体连接、克隆、筛选、测序及同源性检索,并用斑点杂交方法验证检测结果。结果 正常和异型增生组织互为tester和driver成功构建了2个cDNA消减文库,分别代表在异型增生组织中表达上调和下调基因,测序的26个克隆中15个为已知基因,3个为已知EST,8个为新的EST,GenBank登录号为BQ164614-BQ164616,BQ291516-BQ291520,其中15个片段经证实在胃异型增生阶段有显著表达差异。结论 利用本室创建的显微切割-cDNA PCR-SSH法成功构建胃异型增生组织cDNA消减文库,初步筛选部分基因,为寻找胃癌发生相关基因提供重要线索。     

川北地区胃癌特异性表达基因的克隆

目的：构建胃低分化腺癌组织cDNA消减文库,筛选胃癌特异表达基因。方法：取胃低分化腺癌组织和癌旁正常黏膜组织,提取总RNA,逆转录cDNA,进行SSH构建消减文库获得序列标签,与载体连接、克隆、筛选、测序及同源性检索。结果：以癌旁正常黏膜组织为driver、胃低分化腺癌组织为tester成功构建cDNA消减文库,测序结果与公共数据库中已知基因和人类EST比较,获得5个特异性序列标签（NBPF1、FAM48A、RXFP2、ACTB和QDPR）。结论：应用SSH法成功构建胃低分化腺癌组织cDNA消减文库,初步筛选胃癌部分表达基因,为寻找川北地区胃癌发生发展的特异性基因奠定基础。     

应用抑制消减杂交和斑点印迹杂交对膀胱癌差异表达基因的研究

目的：研究膀胱移行细胞癌和正常膀胱黏膜的差异表达基因。方法：应用抑制消减杂交技术(Suppression subtractive hybridization SSH)构建人膀胱移行细胞癌和正常粘膜差异表达的cDNA消减文库，进一步利用斑点印迹杂交(Dot blot)从中筛选出TCC差异表达的基因，随机选取部分克隆进行测序，结果在GenBank中作同源性对比分析。结果：成功构建了具有高消减效率的人TCC的cDNA消减文库，从文库的376个阳性克隆中随机选取100个克隆扩增、筛选后得到89条200～900bp的差异表达基因片段，测序后发现5条未知新基因片段和41种已知基因。结论：利用SSJ和Dot blot研究膀胱癌差异表达基因，为大批量筛选和克隆其差异表达的基因提供了行之有效的方法，也为研究基因功能和TCC的发生机制奠定了基础。     

肺癌诊断基因的初步筛选

目的 筛选肺癌细胞恶性转化不同时期差异表达的基因，以期用于肺癌的诊断。方法 应用抑制消减杂交技术(SSH)、测序、cDNA芯片(cDNA Miemarray)、northern blot。结果 利用SSH建立了永生化人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化不同时期差异表达基因的cDNA文库，其中，A消减文库(BEP2D细胞的cDNA为tester，α粒子照射BEP2D细胞后35代恶性转化细胞R15Hp35的cDNA为driver)有416个克隆，B消减文库(α粒子照射BEP2D细胞后20代转化细胞R15Hp20的cDNA为tester，BEP2D和R15Hp35细胞的cDNA混合后为driver)有301个克隆，C消减文库(R15Hp35细胞的cDNA为tester，BEP2D细胞的eDNA为driver)有586个克隆。对文库中107个克隆单向测序发现：19个克隆在GenBank中没有查到对应的同源序列，其它88个克隆共代表了76个不同的已知基因。然后，将3个文库中全部克隆的cDNA制作成cDNA芯片，用该芯片筛选了15例肺癌组织、5例肺癌旁组织和其他8种癌组织(肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、白血病、子宫内膜癌、脑神经角质瘤和结肠癌)中mRNA的表达差异。结果，获得肺癌组织高于肺癌旁组织表达的eDNA26个，肺癌旁组织高于肺癌组织表达的31个，2者高于其他8种癌组织的分别为：肺癌旁组织中63个，肺癌组织中87个。将这208个具较大差异表达的基因重新制作成cDNA芯片，再选用临床上同一鳞癌病人鳞癌和鳞癌癌旁组织各1例与该芯片杂交，发现这些筛选出的基因的确在癌组织和癌旁组织中存在较大差异。结论 这些初步筛选出的差异表达基因有望成为肺癌诊断的侯选基因。     

SSH方法对食管癌相关差异基因cDNA文库的建立及初步分析

目的建立河北省磁县具有家族史的食管癌组织与食管正常黏膜组织差异表达的cDNA消减文库,并初步筛选过度表达的食管癌差异基因。方法应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)方法对10对食管癌组织及正常食管黏膜组织进行差异基因的消减、克隆、测序、鉴定。结果建立了食管癌差异表达片段cDNA消减文库;并进一步对初步筛选出的20个食管癌差异表达的基因进行测序和同源性分析,得出与肿瘤密切相关的基因10个,分别为锌指蛋白14、锌指蛋白66、肿瘤相关钙信号转运蛋白1,FMNL2基因、真核细胞转录延长因子1A1、肌小管相关蛋白6、Toll样受体10、次级淋巴趋化因子、细胞色素P450酶4F8、桥粒糖蛋白3。结论应用SSH技术成功建立食管癌差异表达基因cDNA消减文库,并获得10个在食管癌组织中过度表达的基因。     

膀胱癌差异表达基因BQ135232的全长克隆及意义

目的 克隆并鉴定膀胱移行上皮细胞癌(BTCC)的差异表达基因.方法 应用抑制消减杂交技术(SSH)构建膀胱癌和其正常上皮组织差异表达的cDNA消减文库,进一步利用斑点印迹杂交筛选出BTCC差异表达的基因, 对其中明显差异表达的BQ135232应用SMART RACE克隆全长,再应用免疫荧光原位杂交进行染色体定位,并应用Northern blot进行差异表达分析.结果 成功构建了人膀胱癌组织的cDNA消减文库,共含有376个阳性克隆和83个阴性克隆.随机挑出的100个阳性克隆中,76个克隆含有肿瘤差异表达的基因片段,对其进行同源性比对分析,其中有66个克隆为已知基因,其余的10个克隆代表5种未知基因.未知基因中BQ135232共有3个拷贝,染色体定位发现其位于第12号染色体近末端处.Northern杂交分析显示它在膀胱癌组织中高表达,而在正常膀胱组织中无明显表达.结论 本研究表明BQ135232是跟膀胱癌发生发展密切相关的新基因,它的成功克隆为阐明膀胱癌发生发展的分子生物学机制开辟了新的途径.     

家族性急性髓系白血病差异表达基因的筛选与鉴定

目的分离家族性急性髓系白血病患者骨髓中差异表达的基因,在基因水平上探讨急性白血病发生发展的分子机制。方法应用Super SMART和抑制性消减杂交（SSH）技术,构建家族性急性髓系白血病cDNA消减文库;应用差异筛选技术进行差异表达片段的筛选与鉴定;测序结果进行BLAST同源性比对分析。结果成功构建了家族性急性髓系白血病cDNA消减文库;克隆、筛选并鉴定了17条基因片段,与已知基因同源,11条为未知基因片段。结论SSH技术是筛选差异表达基因的有效方法;获得多个与细胞增殖和分化相关的已知基因;获得11条新基因EST片段,并被GenBank收录。     

食管癌消减cDNA文库的构建

目的 :采用消减抑制杂交技术 ,研究正常食管粘膜和食管癌组织之间的基因表达差异状况 ,分离食管癌相关基因片段 ,构建食管癌的消减cDNA文库。方法 :以食管癌癌组织为测试子 (tester) ,以正常食管粘膜组织为驱赶子 (driver) ,用消减抑制杂交方法分离食管癌差异表达片段。将该差异表达片段克隆至T载体 ,经蓝白斑筛选后 ,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒 ,构建食管癌消减cDNA文库。结果 :用消减抑制杂交技术分离食管癌差异表达片段 ,经蓝白斑筛选 ,得到 2 2 0个白色克隆 ;再用PCR方法快速筛选出 10 0个两端分别含连接子Adaptor1及Adaptor2R的阳性重组质粒 10 0个 ,从而成功地构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。结论 :构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。消减抑制杂交技术能快速有效地分离差异表达基因 ,方法简便、灵敏度高。使用PCR法快速筛选阳性克隆 ,对于消减文库的构建具有重要意义     

应用抑制消减杂交技术筛选颞叶癫痫的相关基因

目的 构建颞叶癫痫大鼠海马组织差异表达基因的消减cDNA 文库,筛选颞叶癫痫的差异基因。方法 采用抑制消减杂交方法,以正常大鼠和癫痫大鼠的海马组织作为对比材料,分离组织中差异表达基因的cDNA 片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物转化大肠杆菌进行文库扩增后,随机挑取100个白色克隆,用菌落PCR法筛选差异基因克隆,并进行测序分析。结果 获得14个在癫痫大鼠海马组织中有差异表达,并与大鼠的已知基因片段高度同源的基因。 结论 抑制消减杂交技术是一种高效的筛选差异表达基因的方法,颞叶癫痫大鼠海马组织中存在许多差异表达基因,为深入研究癫痫发病的分子机制提供重要线索。     

应用抑制性消减杂交技术研究机体获得热适应后肝脏细胞线粒体呼吸链相关基因的差异表达

目的：研究机体获得热适应后肝脏细胞线粒体呼吸链相关基因的差异表达。方法：常规方法建立大鼠热适应模型，分别从正常大民及热适应大鼠肝脏细胞个提取总RNA并抽提mRNA，按照SSH常规操作方法，构建cDNA消减文库，筛选阳性克隆并加以鉴定以得到带有差异表达基因的克隆。结果：成功构建具有高消减效率的热适应大民肝脏细胞cDNA消减文库，筛选鉴定启发现6个克隆含有差异表达基因。测序结果显示其个3个分别为热休克蛋白基因Hspel、线粒体细胞色素氧化酶C亚单位和NADH脱氢酶亚单位Ⅲ基因ND3。结论：三种基因的差异表达征明了线粒体呼吸铁功能的增强在细胞的代偿功能个的重要作用，线粒体在热适应时动物体对高温的代偿性反应个发挥总参与热耐力形成、提高机体抗热损伤能力的重要作用。     

应用抑制性消减杂交技术筛选脂肪细胞分化相关基因

目的:利用脂肪分化细胞模型筛选与脂肪细胞分化相关的差异性表达基因。方法:采用抑制性消减杂交技术,以诱导分化后的人前体脂肪细胞系SW872总RNA为Tester,诱导分化前的人前体脂肪细胞系SW872为Driver,将消减杂交获得的DNA片段与pGM-T载体连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆。将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,并与GenBank数据库进行同源性分析,获得差异性表达基因。结果:扩增消减cDNA文库获得135个白色克隆,随机挑选64个进行测序,共获得34个阳性克隆基因。结论:本研究成功构建了脂肪细胞分化差异性表达基因的消减cDNA文库,筛选出了与脂肪细胞分化相关的差异表达基因。     

应用抑制消减杂交技术构建哮喘病人嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库

目的构建哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法采用新近建立的抑制消减杂交方法,哮喘治疗前后的嗜酸细胞为试验和对比材料,分离哮喘病人嗜酸细胞中差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T／A连接构建文库,将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选,随机挑取100个白色克隆用菌落PCR进行鉴定。结果扩增消减cDNA文库获得3000余个白色阳性克隆,随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增,90％的克隆中均有200～600bp的插入片段,这些片段可能是哮喘嗜酸细胞差异表达基因的cDNA片段。结论用SSH法及T／A克隆技术成功构建了哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库,该消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆哮喘病人嗜酸细胞差异表达的新基因奠定了基础。     

人小细胞肺癌多药耐药细胞差异表达基因的克隆研究

目的 构建小细胞肺癌多药耐药细胞(H446/CDDP)差异表达消减cDNA文库.方法 ①以H446/CDDPcDNA为实验方(Tester),小细胞肺癌细胞H446 cDNA为对照方(Driver),应用抑制消减杂交(SSH)技术结合T/A克隆技术构建小细胞肺癌多药耐药细胞差异表达消减cDNA文库.②通过斑点杂交筛选、测序及同源性分析获取H446/CDDP细胞差异表达cDNA片段.结果 成功构建了小细胞肺癌多药耐药细胞H446/CDDP差异表达消减cDNA文库,获得21个H446/CDDP细胞差异表达cDNA片段,经测序及同源性分析表明它们分别代表6个已知基因(同源性为96%～100%).结论 SSH技术是筛选新的功能基因的有效方法;获取的6个差异表达基因可能参与了小细胞肺癌多药耐药细胞H446/CDDP的耐药形成,进一步的功能研究有利于了解它们在小细胞肺癌多药耐药机制中所发挥的作用.