人骨髓间充质干细胞对脐血干细胞体外扩增支持作用的研究

目的：探讨以人骨髓间充质干细胞(bone nlarrow-mesenchymal stem cells，BM-MSC)为基质的无血清培养方法，体外扩增脐血造血干细胞(cord blood stem cells，CBSC)，研究BM—MSC支持造血的功能，以能最终用于临床。方法：用含血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、fit3／flk2配体(FL)和粒细胞-集落刺激因子(G—CSF)的无血清培养液，比较有或无MSC条件下，体外扩增脐血CD34^ 细胞两周后检测总细胞TC、CD34^ 细胞、集落形成单位(CFU)和长期培养-起始细胞(LTC—IC)增加倍数。结果：在TPO、FL、SCF、和G-CSF的作用下，经两周体外扩增后有MSC组的TC、CD34^ 细胞、CFU—GM、CFU—C和LTC—IC数较起始分别增加了427、39、125、104和16倍。单纯用上述4种细胞因子的无MSC组，TC、CD34^ 细胞、CFU—GM、CFU—C数分别增加了62、11、25、24倍，但LTC-IC只有扩增前的0．8倍。结论：以人BM—MSC为基质的无血清体外培养体系可以更有效扩增CBSC，有潜在的临床应用价值。     

人胎盘提取物对脐带血造血干细胞的体外扩增实验研究

目的 研究人胎盘提取物对脐带血造血干细胞体外扩增的影响.方法 分离脐带血造血干细胞体,用常规培养法和加入人胎盘提取物的方法 进行体外扩增培养,扩增培养第1、2、3、4周分别进行单个核细胞(MNC)计数和造血祖细胞集落培养及计数.结果 到第4周时胎盘提取物组MNC扩增最高可达78.25倍,而常规培养组仅增加了8.32倍;造血祖细胞集落计数显示第3周达高峰,第4周逐渐下降,但胎盘提取物组扩增集落形成细胞(CFC)的能力明显高于常规培养组.结论 胎盘提取物能有效促进脐带血造血干细胞的体外增殖,但应避免长时间的体外扩增培养,以防止细胞发生分化,影响扩增质量.     

两种条件培养基促进鼠胚胎干细胞分化为造血干细胞

目的:从鼠胚胎干细胞获得具有造血重建功能的造血干细胞.方法:将ES-D3细胞形成4天拟胚体(4dEBs),再用骨髓内皮细胞条件培养液(mBMEC-CM)和/或胎肝基质细胞条件培养液(FLSC-CM)诱导4dEBs生成造血干细胞.实验为mBMEC-CM FLSC-CM组、mBMEC-CM组、FLSC-CM组,对照组.检测诱导生成的细胞造血干细胞特异抗原表达、造血相关基因表达、造血集落的形成以及造血重建能力.结果:从诱导ES-D3细胞生成造血干/祖细胞的数量和生成的集落总数看,mBMEC-CM FLSC-CM组诱导效率显著高于其他3组.mBMEC-CM FLSC-CM组诱导生成的细胞能重建照射鼠的造血系统.结论:骨髓内皮细胞条件培养液联合胎肝基质细胞条件培养液可促进鼠胚胎干细胞分化为具有造血重建能力的造血干细胞.     

人骨髓基质干细胞克隆的培养及其向神经元样细胞的定向诱导分化

目的：探讨人骨髓基质干细胞克隆的体外长期培养方法及其生物学特性。方法：贴壁生长的基质干细胞以套环法消化分离，扩增培养，待细胞融合，传代培养，检测细胞的生长曲线，表面标记、克隆形成能力和向神经元定向诱导分化的潜能。结果：克隆培养的骨髓基质干细胞能传代20代以上，表达CD13，CD29，CD59，不表达CD11，CD14，CD31、CD34，CD45，CD80，CD86，CD117，HLA－DR；传代17代时能诱导分化为神经元样细胞。结论：该培养条件能有效扩增骨髓基质干细胞，并保持分化潜能，克隆来源的骨髓基质细胞有相同的生物学特性。     

不同条件下体外扩增造血细胞促造血恢复能力的比较

目的 比较研究不同条件下体外扩增的造血细胞回输体内后促进造血功能恢复作用的差异，方法 在小鼠骨髓单个核细胞液体培养体系中，分别加入几种细胞因子组合和／或基质细胞层存在的条件下进行体外扩增，然后将不同条件下扩增的细胞经尾静脉回输至经致死量照射的小鼠体内，动态观察小鼠的外周血象变化及其一般状况和生存率。结果 ①单纯细胞因子介导BMMNC体外扩增后并不能增进这些细胞促造血恢复的能力；②含有骨髓基质细胞底层的体外扩增，无论是否加入细胞因子，均有明显的促进移植受体造血功能迅速恢复的作用。结论 骨髓基质细胞支持下的造血细胞体外扩增可能有助于维持扩增后造血干／祖细胞造血重建的功能，值得深入研究和应用。     

脐血造血细胞体外集落培养最佳收获时机的探讨

目的 探讨脐血（CB）多系造血集落培养在不同培养条件下脐血造血细胞体外扩增的最佳收获时机。方法 将从新鲜CB标本中分离出的单个核细胞（MNC）分别接种于已建立的无血清培养基，该培养基分别含单用人骨髓基质细胞、单用细胞因子及细胞因子联合入骨髓基质细胞（HBMSC）支持培养体系。在0、6、10及14d各时间点分别取细胞进行巨细胞集落形成单位（CFU—MK）、红乐爆式集落形成单位（BFU—E）及粒单细胞集落形成单位（CFU—GM）培养。结果在体外培养过程中，第10d时各组CFU—MK、BFU—E及CFU—GM数均高于组内其它时间点（P〈0．05）；在含HBMSC支持培养的组集落生成数优于其它组（P〈0．05）。结论 脐血MNC体外培养过程中，第10d可能是收获的最佳时机。FIBMSC能更好地维持造血干／祖细胞的活性，使其集落形成能数得到有效扩增。     

人脐血免疫学细胞的生物学特性

目的：由于脐血比骨髓含有更原始、更强的增殖、分化能力，能重建长期造血的干／祖细胞，这些细胞可在体外大量扩增，使脐血移植有望取代骨髓移植；方法：利用脐血中包含某些细胞，如CD8^ T细胞能在小鼠体内产生细胞因子或者CD34^ 细胞具有内在性增殖潜能或NOD／SCID基质是一种特别的环境来支持外源干细胞移植；结果：脐造血细胞作为基因治疗的理想靶细胞；结论：随着国际上对脐血免疫细胞的生物学特性与功能研究不断深入，进一步确证CBSCT的有效性及巨大应用价值。     

人骨髓基质干细胞克隆的培养及其向神经元样细胞的定向诱导分化

目的探讨人骨髓基质干细胞克隆的体外长期培养方法及其生物学特性。方法贴壁生长的基质干细胞以套环法消化分离,扩增培养,待细胞融合,传代培养。检测细胞的生长曲线、表面标记、克隆形成能力和向神经元定向诱导分化的潜能。结果克隆培养的骨髓基质干细胞能传代20代以上,表达CD13、CD29、CD59,不表达CD11、CD14、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、HLA-DR;传代17代时能诱导分化为神经元样细胞。结论该培养条件能有效扩增骨髓基质干细胞,并保持分化潜能;克隆来源的骨髓基质细胞有相同的生物学特性。     

基质细胞对小鼠骨髓单个核细胞体外扩增的促进作用

目的 阐明基质细胞在造血细胞体外扩增中的作用。方法 采用骨髓基质细胞培养、骨髓单个核细胞（BMMNC）体外液体培养和各种造血相细胞集落培养技术,进行基质细胞支持条件下骨髓单个核细胞体外扩增的研究,并与单纯细胞因子支持下的细胞扩增进行比较。结果 在照射后细胞层存在的条件下,同时含有细胞因子组合的培养体系,对细胞总数和集落形成细胞数的扩增作用明显高于其它各组。结论 基质细胞对细胞因子作用下的造血细胞体外扩增有明显的促进作用。     

骨髓基质细胞支持CD34+细胞扩增的实验研究

目的体外模拟造血微环境，观察CD34^ 细胞在骨髓基质细胞支持下的扩增效应。方法将免疫磁珠阳性选择分选的骨髓CD34^ 细胞接种于构建的基质细胞层培养，通过骨髓基质细胞支持CD34^ 扩增的细胞总数及集落形成细胞数(Colonyforming Cell。CFC)的变化，评价骨髓基质细胞支持CD34^ 细胞扩增的功能。结果 扩增后细胞总数及CFC数分别增加，表示骨髓基质细胞能很好地支持CD34^ 细胞扩增。结论 体外证实了骨髓基质细胞在造血干细胞更新、增殖中具有重要作用。     

In vitro culture of human bone marrow mesenchymal stem cell clonies and induced differentiation into neuron-like cells.

OBJECTIVE: To study the long-term in vitro culture of human bone marrow mesenchymal stem cells (hMSC) and their phenotypical and functional properties. METHODS: Adherent hMSC colonies were digested by 0.25% trypsin-EDTA with a clone cycle for in vitro subculture. Flow cytometry was employed to examine the phenotypes of the cells. Their committed differentiation potential to neurons, clone-forming ability and growth curves were all investigated. RESULTS: hMSCs could be subcultured under this culture condition for 20 passages, expressing CD13, CD29 and CD59 but not CD11, CD14, CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117 and HLA-DR. The cells could be induced to differentiate into neurons when subcultured for 17 passages. CONCLUSION: hMSCs can be efficiently expanded under this culture condition, and the colony-derived hMSCs can maintain the differentiation potentials and retain their biological characteristics.     

中晚孕期与足月胎儿脐血干/祖细胞功能特性研究

目的　对比研究中、晚孕期和足月胎儿脐血造血干 /祖细胞的表型及功能特性 ,为造血干细胞宫内移植和基因治疗先天性疾病提供新的思路。方法　采用免疫磁珠分离法、流式细胞术、液体培养、半固体甲基纤维素培养等对中、晚妊期及足月胎儿脐血造血干 /祖细胞比例、对细胞因子的反应性、体外增殖及自我更新能力进行了测定。结果　未足月脐血中CD34+ 、CD34+ CD38- 细胞及CD34+ 细胞中CD34+ HLL DR+ 、CD34+ CD38- 细胞比例较足月脐血高 (平均 3 1 4 %、0 76 %比 0 78%、0 1 8%及 9 8%、2 0 4%比 3 9%、1 4 6 % ) ,产生的集落形成单位量 (CFU)较足月脐血高 ,且与CD34+ 细胞比例成正相关 (r =0 83) ,长期培养启动细胞 (LTC IC)约是足月脐血的 3倍 (5 7± 1 2 / 1 0 5细胞比1 7± 0 8/ 1 0 5细胞 ,P <0 0 5)。在短期液体培养体系中 ,不同胎龄脐血干 /祖细胞具有相似的扩增潜能 ,体外细胞因子支持下培养 7天 ,CFU C、细胞总数、CD34+ 细胞数、CD34+ CD38- 细胞数达高峰 ,之后逐渐下降 ,其中以SCF +FL +TPO +IL 3 +IL 6组合条件下效果最显著。结论　未足月胎儿 (尤其是中妊期 )脐血与足月胎儿脐血相比 ,含有较高的造血干 /祖细胞 ,有较强的集落形成能力 ,对细胞生长因子刺激敏感 ,在体外能有效地扩增和     

人骨髓间充质干细胞分离培养鉴定及VEGF基因的转染

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSC）分离培养、鉴定方法及人血管内皮生长因子（hVEGF）165基因转染hMSC后表达情况,拟构建血管化组织工程皮肤.方法：用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,筛选贴壁细胞培养并传代.观察细胞形态,生长情况.检验细胞CD44、CD29、CD14、CI45等表面标记.利用基因重组技术,构建pCDN3.1＋VEGF表达质粒,并将其转染第3代hMSC.经G418抗性筛选后扩大培养并用Western blot实验检测其蛋白产物.结果：骨髓密度梯度离心法分离hMSC,接种培养瓶后26 h呈对数生长,6d后达到高峰.hMSC表达CD29,CD44,不表达造血细胞标记物CD14和CD45.通过酶切鉴定验证成功构建pCDN3.1＋ VEGF表达质粒.Western blotting实验证实转染后hMSCs表达VEGF增加.结论：成功建立hMSC分离培养鉴定体系.利用基因重组技术可成功将hVEGF基因导入hMSC并产生预期效应.     

脂多糖对脐血CD34^＋细胞体外增殖的影响

目的：研究脂多糖（LPS）对脐血干／祖细胞体外增殖的影响,探寻脐血干／祖细胞体外扩增的新方法。方法：将不同浓度的自制脂多糖和标准脂多糖分别加入含有脐血CD34^＋细胞的液体培养体系中培养,采用MTT测定方法分别测定脐血CD34^＋细胞增殖率。结果：不同浓度的自制脂多糖与标准脂多糖均可出现低浓度促进脐血CD34^＋细胞增殖,高浓度抑制其增殖的作用。最佳效应浓度分别在30U／mL及10mg／L。结论：脂多糖对脐血CD34^＋细胞体外增殖可能具有调节作用。     

细胞因子FL、TPO对脐带血造血干细胞的扩增作用

目的:通过体外分离培养人新鲜脐带血(Umbilical cord blood,UCB)造血干细胞(Hematopoietic stem cell,HSC),探讨不同细胞因子组合对HSC的扩增作用.方法:采用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离UCBHSC,加入不同组合的细胞因子,检测有核细胞(Nuclear cell,NC)总数和CD34 细胞数.结果:未加细胞因子的对照组培养初期细胞即已破裂溶解,加入不同细胞因子组合的实验组的NC细胞总数和CD34 细胞数随着培养时间的延长均呈现不同程度的增加,于第14天达到高峰,而含有细胞因子FL、TPO的组合,NC细胞数和CD34 细胞数均比较高.结论:体外HSC培养,加入细胞因子对细胞增殖有明显的作用,而细胞因子FL、TPO协同作用能比较好的扩增早期造血干细胞.     

VIP对人脐血CD34+细胞向肝系分化的影响初探

目的探讨血管活性肠肽(VIP)对人脐血造血干细胞(HSC)向肝系分化的影响.方法采用免疫磁分选技术纯化人脐血CD34+细胞,流式细胞术鉴定纯度;VIP和混合因子(包括VIP、EGF、HGF)作用CD34+细胞后,酶联免疫化学法测定CD34+细胞及上清AFP水平,免疫细胞化学法检测CD34+细胞上肝系标志AFP、白蛋白(ALB)、细胞角质素19(CK-19)的表达,Western blot方法检测CD34+细胞上ALB表达;巢式RT-PCR方法检测CD34+细胞上AFP、ALB的mRNA表达,随机选送ALB产物测序.结果免疫组化结果显示CD34+细胞上不表达CK-19蛋白,但有AFP和ALB蛋白表达;VIP作用CD34+细胞14 d后, 细胞内的AFP质量浓度(165.00±8.51 pg/mL)较对照组(270.00±11.37 pg/mL)显著下降(P<0.05).Western blot显示VIP作用后CD34+细胞内ALB蛋白表达有减弱趋势.人脐血CD34+细胞表达了AFP mRNA和ALB mRNA,随机选取ALB产物测序与GeneBank中ALB基因序列完全相同.结论人脐血CD34+细胞表达肝系标志AFP、ALB,虽未见CK-19表达,但仍提示造血干细胞有向肝细胞横向分化的可能.VIP降低了人脐血CD34+细胞AFP及ALB表达.这种对造血干细胞内胚层细胞标志物表达的抑制,提示VIP对HSC向肝细胞横向分化具有抑制作用.     

大鼠表皮干细胞的定位、分离和体外培养

目的：定位大鼠的表皮干细胞,探讨表皮干细胞分离和体外培养的方法。方法：用免疫组化法定位表皮干细胞。用胶原酶冷、温消化和胰蛋白酶联合消化新生鼠皮肤,获得单细胞悬液。选取在鼠尾胶原上快速贴壁的细胞为目的细胞,未快速贴壁的细胞为对照组,二者在相同条件下培养,适时传代,测定细胞克隆形成率．免疫学方法鉴定表皮干细胞。结果：毛囊隆突区细胞胞浆表达角蛋白15（K15）随年龄的增长,K15阳性细胞出现在毛母质细胞区和表皮基底层。体外培养的细胞能形成大克隆,克隆形成率为14．06％,传至第4代,细胞形态无明显改变,细胞浆内表达K15。结论：表皮干细胞位于毛囊隆突区,此研究所用的方法可以分离、纯化和培养表皮干细胞。     

微小RNA可在人骨髓间充质干细胞分化来源的心肌样细胞中表达

目的研究人骨髓间充质干细胞（hMSCs）分化来源的心肌样细胞中代表性微小RNA（miRNAs）的表达。方法利用FITC-偶联的CD29、CD34和CDllb抗体在流式细胞仪上检测分离的hMSCs的抗原表型。分别用5-氮胞苷（5-aza）和乳鼠心肌非接触共培养法诱导传至3代的hMSCs分化为心肌样细胞。用免疫化学法检测hMSCs分化来源的心肌样细胞中心肌特异的α-肌节辅肌动蛋白和心肌肌钙蛋白（cTnI）的表达：利用逆转录PCR和DNA测序鉴定5个代表性的心脏特异的初级微小RNA（pri-miRNAs）的表达。结果hMSC标志分子CD29表达率为98．87％．而造血细胞标志分子CD34和CDllb的表达率只是5％和0．4％。免疫化学分析显示．分别经5-aza和乳鼠心肌非接触共培养诱导的hMSC均可表达α-肌节辅肌动蛋白和cTnI，而在未分化的hMSCs中无表达。miRNA-143，-181可在5-aza诱导的hMSCs中表达，miRNA．143，-181，-206，-208可在乳鼠心肌非接触共培养的hMSCs中表达．而两种诱导方法均未能诱导miRNA-1-2在hMSCs中表达。结论利用5-aza和乳鼠心肌非接触共培养法诱导hMSCs分化的心肌样细胞中可以表达不同的心脏特异的pri-miRNAs。     

丹参注射液诱导间质干细胞分化为神经元样细胞

[目的]丹参注射液体外定向诱导成人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞.[方法]采用Ficoll-Paque液离心分离成人MSC,体外扩增,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达,分别采用含丹参注射液或硫代甘油等试剂的无血清达乐伯克改良必需基本培养基(DMEM)诱导MSC分化为神经元,免疫组化鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(nestin)的表达.[结果]成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得0.5×106,15代可获得(2～3)×1012个细胞,细胞流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD90、CD105、CD166表达阳性,CD11a、CD14、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86为阴性.加入丹参或硫代甘油诱导后,MSC胞体收缩,突起伸出;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF-M、nestin表达阳性,GFAP阴性.[结论]丹参可以在体外诱导成人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞.