K562和K562/AO2细胞HLA Ⅰ类分子与MICA/B的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响

本研究探讨K562亲本细胞株及多药耐药细胞株K562/AO2细胞表面HLA Ⅰ类分子和MHC Ⅰ类链相关分子(MICA/B)的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响.用流式细胞仪检测K562和K562/AO2细胞株HLAⅠ类分子和MICA/B的表达情况;LDH释放法测定3例健康人NK细胞在不同效靶比时对K562和K562/AO2细胞的杀伤活性;效靶比101时,用抗HLA Ⅰ类分子单克隆抗体(W6/32)和抗MICA/B单克隆抗体(BAMO-1)分别封闭MHC Ⅰ类分子和MICA/B,观察NK细胞杀伤K562及K562/AO2细胞活性的变化.结果表明K562和K562/AO2细胞均不表达HLA Ⅰ类分子,K562细胞的MICA/B表达较K562/AO2显增高(P＜0.01).效靶比51、101、201、301时NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性分别为(29.32±0.12)%、(45.33±0.78)%、(58.37±0.87)%、(72.37±0.96)和(12.47±0.91)%、(24.36±1.11)%、(33.29±1.03)%、(53.87±1.27)%,各效靶比时NK细胞对K562细胞的杀伤活性较K562/AO2细胞明显增强(P=0.000);效靶比101时W6/32不抑制NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性,BAMO-1能明显抑制NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性.结论MICA/B在K562和K562/AO2细胞表达的差异与NK细胞的杀伤活性有关;NK细胞对K562/AO2细胞杀伤活性降低与HLA Ⅰ类分子无关;MICA/B在多药耐药肿瘤细胞的低表达导致耐药肿瘤细胞对NK细胞杀伤敏感性下降.     

以SEAM预处理方案行自体外周血干细胞移植治疗非何杰金淋巴瘤

背景:造血干细胞移植治疗非何杰金淋巴瘤前,预处理方案对移植效果至关重要.目前经典BEAM方案中的药物卡莫司汀在国内不易购得,且该方案毒副作用较大,复发率较高.目的:以司莫司汀取代卡莫司汀组成SEAM预处理方案,观察自体外周血干细胞移植治疗非何杰金淋巴瘤的效果.设计、时间及地点:病例分析,于2003-06/2006-02和解放军成都军区昆明总医院血液科进行.对象:选取同期收治的15例Ⅲ～Ⅳ期非何杰金淋巴瘤患者,男13例,女2例,平均年龄43.8岁,均经过2～8个疗程的制化疗,CR1 4例,CR2 1例,部分缓解10例;病理证实T细胞淋巴痛3例,弥漫大B细胞淋巴瘤12例;移植前复查肝肾功能及肺功能均正常.组成SEAM预处理方案的4种药物:司莫司汀(Semustine)为浙江瑞新公司产品,批号20071 125;足叶乙甙(Etopside)为江苏恒瑞公司产品,批号07101231:阿糖胞苷(Ara-C)为浙江海正公司产品,批号080103A;马法兰(Mephalan)为葛兰素史克产品,批号7001.方法:皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子动员后12 d采集患者外周血干细胞,与羟乙基淀粉、人血白蛋白及二甲基亚砜配成冻存液移植备用.动员后1个月行自体外周血干细胞移植,移植前患者行SEAM预处理方案:移植前8 d门服司莫司汀320 mg/m2.移植前7 d-移植前4 d,静滴足叶乙甙200 mg/m3,1次/d;静滴阿糖胞苷200 mg/m2,1次/12 h.移植前3 d～移植前2 d,静滴马法兰70 mg/m2,1次/d.移植当天将预先冻存的自体外周血干细胞水浴解冻,经锁骨下静脉插管快速回输给患者,一般输注细胞量为(3.0～5.0)×108/kg.主要观察指标:①预处理的毒副作用.②移植后造血功能恢复.③疾病转归. 结果:SEAM颅处理过程中15例患者均出现不同程度消化道反应,1例出现心动过速,3例出现肝功能损害.所有患者在自体外周血干细胞移植后造血功能均快速重建.中件粒细胞计数≥0.5×109L-1的中位时间为11 d,血小板计数≥20×109 L-1的中位时间为13 d.中位随访时间39个月,13例患者无病存活,2例分别于移植后4,13个月死于疾病复发.结论:非何杰金淋巴瘤患者对SEAM预处理方案耐受性好,该方案毒副作用轻微,造血重建恢复较快,目前随访治疗效果较好.     

手霉素通过线粒体凋亡途径诱导U937和HL-60细胞凋亡

目的 研究法尼酰基转移酶抑制剂手霉素（Manumycin）诱导白血病细胞凋亡的机制。方法 用2μmol／L手霉素处理白血病细胞系U937和HL-60细胞不同时间，用流式细胞术检测细胞凋亡。免疫印迹技术检测细胞色素C、caspase9、caspase8、caspase3的表达。用荧光染料JC-1检测法测定线粒体膜电位（Δψm），并用caspase抑制剂Z—VAD—fmk阻断caspase的活化，探讨caspase在手霉素诱导白血病细胞凋亡中的作用。结果 2μmol／L手霉素处理U937和HL-60细胞16h，Δψm显著下降，相对值分别是0．51±0．07和0．41±0．06（P〈0．01）。手霉素诱导细胞色素C从线粒体释放到细胞质，激活caspase-9、caspase8和caspase-3。50μmol／L的Z—VAD—fmk可完全阻断caspase激活，但仅部分阻断手霉素诱导的U937和HL-60细胞凋亡，细胞凋亡率分别减少51．69％和56．47％。结论 手霉素通过线粒体途径诱导U937和HL-60细胞凋亡。     

自体外周血干细胞移植联合单倍体淋巴细胞输注治疗恶性血液病

为观察自体外周血干细胞移植联合单倍体淋巴细胞输注治疗恶性血液病的疗效和不良反应 ,对完全缓解或部分缓解的恶性血液病患者用中剂量阿糖胞苷 (1.g/m2 × 5天 )或环磷酰胺 (6 0mg/kg× 2天 )联合G CSF方案动员干细胞 ,并经程序降温仪冷冻 ,- 196℃保存。用Bu/Cy或TBI/Cy方案对患者预处理后 ,回输未净化的自体干细胞。当患者白细胞恢复至 1.0× 10 9/L时 ,输注经 7.5Gy照射的单倍体淋巴细胞 (平均 5 .0× 10 7/kg) ,观察患者造血恢复、疾病转归和长期生存率。结果表明 ,12例接受该方案治疗的患者中 ,5例急性非淋巴细胞白血病患者呈持续缓解状态 ,其中 2例无病生存超过 5 0个月 ;3例IV期恶性淋巴瘤患者中 1例长期缓解 ,2例分别于治疗后 4和 6个月复发而死亡 ;1例淋巴瘤 白血病患者持续缓解 18个月 ,2例慢性粒细胞白血病患者也呈持续缓解状态 ,1例多发性骨髓瘤患者持续缓解 36个月后复发 ,但经反应停治疗目前仍处完全缓解状态。平均随访 2 5个月 ,10例无病生存 ,2年无病生存率 83%。单倍体淋巴细胞输注后在部分患者中除血小板恢复延迟外 ,未见严重不良反应。STR PCR示单倍体淋巴细胞输注后 72小时供者淋巴细胞在受者体内消失。结论 :自体干细胞移植联合单倍体淋巴细胞输注可减少急性白血病的复发 ,提高自     

HLA5/6位点不全相合外周血干细胞移植治疗慢性髓系白血病加速期一例

患者 ,男 ,30岁。因左上腹剧烈疼痛 3ｄ于 1998年 5月15日第 1次入我院 ,诊断慢性髓系白血病 (ＣＭＬ) ,经常规化疗病情稳定在慢性期。 1999年 12月出现腹部及腰背部剧烈疼痛 ,伴发热 ,体重下降 ,血小板异常增多 [(10 83～ 15 73)×10 9/Ｌ],Ｘ线胸片提示白血病细胞肺部浸润 ,在山东医科大学确诊为ＣＭＬ加速期 (ＣＭＬ ＡＰ)。以ＣＯＰ(环磷酰胺、长春新碱、泼尼松 )联合化疗 1个疗程 ,腰背部疼痛减轻 ,但骨髓未完全缓解。经患者及家属同意行ＨＬＡ5 / 6位点不全相合异基因外周血干细胞移植术。供者为其胞兄 ,39岁 ,外周血及骨髓检查正常 ,…     

K562和K562/AO2细胞HLA I类分子与MICA/B的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响

本研究探讨K562亲本细胞株及多药耐药细胞株K562/AO2细胞表面HLAI类分子和MHCI类链相关分子(MICA/B)的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响。用流式细胞仪检测K562和K562/AO2细胞株HLAI类分子和MICA/B的表达情况;LDH释放法测定3例健康人NK细胞在不同效靶比时对K562和K562/AO2细胞的杀伤活性;效靶比10∶1时,用抗HLAI类分子单克隆抗体(W6/32)和抗MICA/B单克隆抗体(BAMO-1)分别封闭MHCⅠ类分子和MICA/B,观察NK细胞杀伤K562及K562/AO2细胞活性的变化。结果表明:K562和K562/AO2细胞均不表达HLAI类分子,K562细胞的MICA/B表达较K562/AO2明显增高(P<0.01)。效靶比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1时NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性分别为(29.32±0.12)%、(45.33±0.78)%、(58.37±0.87)%、(72.37±0.96)和(12.47±0.91)%、(24.36±1.11)%、(33.29±1.03)%、(53.87±1.27)%,各效靶比时NK细胞对K562细胞的杀伤活性较K562/AO2细胞明显增强(P=0.000);效靶比10∶1时W6/32不抑制NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性,BAMO-1能明显抑制NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性。结论:MICA/B在K562和K562/AO2细胞表达的差异与NK细胞的杀伤活性有关;NK细胞对K562/AO2细胞杀伤活性降低与HLAI类分子无关;MICA/B在多药耐药肿瘤细胞的低表达导致耐药肿瘤细胞对NK细胞杀伤敏感性下降。     

TJU103体外诱导造血干细胞移植的免疫耐受

目的:前期研究表明,吲哚亚甲基异烟腙(简称TJU103)可以明显降低异基因造血干细胞移植小鼠移植物抗宿主病的发生率和程度,明显延长小鼠移植后的生存期.实验拟观察TJU103诱导造血干细胞移植免疫耐受和对移植物抗白血病的影响,探索一条既能降低移植物抗宿主病又能保留移植物抗白血病的移植途径.方法:实验于2007-07/10在南方医科大学珠江医院血液科实验室完成.①实验材料:人急性髓系白血病细胞株KG1a由中国医学科学院血液学研究所宋增璇教授惠赠.10份自愿捐献的健康人外周血白细胞由广州市中心血站提供,等分为供者与受者.②实验方法:采用梯度密度沉淀法常规分离人外周血单个核细胞.以供者外周血单个核细胞作为反应细胞,受者正常外周血单个核细胞作为刺激细胞,体外建立异基因造血干细胞移植中供、受者间的单向混合淋巴细胞反应体系,应用TJU103阻断CD4 T细胞激活的抗原信号通路,设单独刺激细胞和反应细胞对照以及1640完全培养基空白对照.③实验评估:于培养第1、3、5天应用MTT检测TJU103对供者淋巴细胞的增殖活性的影响,于第5天用乳酸脱氢酶释放法分别检测10∶1, 20∶1,40∶1效靶比时供者淋巴细胞对受者单个核细胞和急性髓系白血病细胞KG1a的细胞毒活性影响,同时采用流式细胞仪检测CD4 CD25 T细胞的百分比.结果:第3天和第5天实验组A值低于对照组 (P < 0.05).单向混合淋巴细胞5 d后实验组各效靶比供者T细胞杀伤受者外周血单个核细胞的活性明显低于对照孔 (P < 0.05);二者对KG1a细胞的杀伤活性差异不显著 (P > 0.05).TJU103对供者CD4 CD25 T细胞无影响.结论:TJU103降低T淋巴细胞增殖反应的同时并不影响其抗白血病效应,有望用于临床异基因造血干细胞移植中移植物抗宿主病和移植物抗白血病的免疫调节.     

同种异体NK细胞对CD+34早期急性髓系白血病细胞的杀伤活性

目的探讨同种异体NK细胞对CD3+4早期急性髓系白血病(AML)细胞的体外杀伤活性。方法免疫磁珠法分离5例健康个体NK细胞,以NK杀伤敏感细胞株K562作为对照,乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定不同效靶比时NK细胞对CD3+4早期AML细胞KG1a的杀伤活性。结果AML细胞株KG1a中CD34抗原表达率为98.0%±1.1%,分选后的NK细胞纯度为93.2%±3.7%。不同效靶比时NK细胞对KG1a细胞均有杀伤活性,且随着效靶比的增高,其杀伤活性增高(P<0.05)。结论同种异体NK细胞对CD34+早期AML细胞具有一定的杀伤活性。     

苦参碱对白血病KG1a细胞增殖及凋亡的影响

目的 观察苦参碱对人急性髓白血病细胞株KG1a体外增殖抑制和凋亡的影响.方法 CCK-8法和台盼蓝拒染色法检测苦参碱对KG1a细胞增殖抑制作用和细胞存活率;甲基纤维素培养体系分析细胞克隆形成能力;流式细胞仪法检测作用前后KG1a细胞的凋亡率及细胞周期变化.结果 苦参碱能够抑制KG1a细胞增殖,随着药物浓度增大和作用时间延长,抑制率逐渐升高、存活率逐渐下降;作用后细胞克隆形成率明显低于对照组(P＜0.05);各浓度药物组均能诱导KG1a细胞凋亡;苦参碱作用后细胞大部分被阻于Go/G1期.结论 苦参碱能抑制KG1a细胞的增殖,改变其周期,诱导其凋亡.     

阿霉素预处理的小鼠红白血病细胞降低红白血病细胞的成瘤性

目的: 研究阿霉素(ADM)处理的小鼠红白血病(MEL)细胞是否可以发生免疫原性死亡,预先输注此细胞是否可以降低MEL细胞在昆明(KM)小鼠体内的成瘤性。方法: 用ADM诱导MEL细胞发生约70%凋亡率,即发生免疫原性死亡。 30只KM小鼠分3组,分别为小鼠红白血病模型组(模型组)、ADM诱导治疗组(ADM组)和空白对照组(对照组)。模型组经尾静脉输注PBS给KM小鼠,8 d后输注MEL细胞1×10⁶/只;ADM组经尾静脉输注ADM处理的MEL细胞给KM小鼠,9×10⁶/只,8 d后输注MEL细胞1×10⁶/只;对照组未行任何人为干预。观察各组小鼠的生存时间、濒死或第80 d 时外周血白细胞数目和体重。结果: 在体外使用4 mg/L 阿霉素作用于MEL细胞24 h后,诱导MEL细胞约70%凋亡率,发生了免疫原性死亡。在小鼠体内,观察80 d,对照组小鼠全部存活, 模型组全部成瘤死亡,ADM组有1只长期生存。ADM组与模型组相比较,生存时间延长(P<0.01),濒死或第80 d 时外周血白细胞数目降低(P<0.01),濒死或第80 d 时体重增加(P<0.01)。结论: 将发生免疫原性死亡的MEL细胞预先输注到KM小鼠体内,KM小鼠产生抗肿瘤免疫应答,降低了活性MEL细胞在KM小鼠体内的成瘤性,改善KM小鼠生存时间和生存质量。