肝细胞原代培养的常用添加物

随着肝细胞在生化研究、药代动力学研究、毒理学研究、人工肝支持系统及肝细胞移植方面越来越广泛的应用，如何获得完好无损的肝细胞及长期、稳定地培养活力和功能均良好的肝细胞，是首先要解决的问题。本文就肝细胞原代培养的常用添加物作了综述。     

体外人原代肝细胞分离与培养及冻存研究

目的通过对人原代肝细胞分离、培养、冻存,研究冻存前后肝细胞的形态功能,以期为生物人工肝、肝细胞移植的研究及应用提供细胞来源。方法采用多点穿刺两步灌流法分离原代肝细胞,体外预培养24 h,经程序降温盒冷冻法短期冻存。复苏后对细胞的活力、形态、微生物污染及相关功能基因表达进行测定。结果复苏后,肝细胞存活率达到(71.6±2.2)%,相较新鲜分离的肝细胞,存活率达到90%以上,体外培养时间长达12天,无微生物污染,复苏前后白蛋白(ALB)、谷氨酰胺合成酶(GS)、氨甲酰磷酸合酶1(CPS1)以及细胞色素酶P450 3A4(CYP3A4)功能基因表达无统计学差异(P>0.05)。结论初步建立了人原代肝细胞分离、培养、冻存方法,为生物人工肝及相关肝细胞治疗奠定了研究基础。     

培养基中的化学成分对原代培养肝细胞的影响

利用体外培养的肝细胞作为试验和研究手段,用于药理学、毒理学及生物型人工肝的研究进展较为迅速,其重点在于如何保持体外肝细胞的增殖能力和分化特性,以获得高密度生长的肝细胞。文中对近年来培养基中的化学成分对原代培养肝细胞的影响予以探讨。     

培养基中的化学成分对原代培养肝细胞的影响

利用体外培养的肝细胞作为试验和研究手段，用于药理学、毒理学及生物型人工肝的研究进展较为迅速，其重点在于如何保持体外肝细胞的增殖能力和分化特性，以获得高密度生长的肝细胞。文中对近年来培养基中的化学成分对原代培养肝细胞的影响予以探讨。     

福建水华微囊藻粗毒素对原代培养大鼠肝细胞毒性作用的初步研究

[目的]用直接分离法进行大鼠肝细胞体外培养．研究微囊藻毒素的毒性。[方法]以大鼠作为肝细胞供体,用直接分离法制备肝细胞,进行原代培养后加入不同浓度的藻毒素;在培养的不同时期用台盼蓝排斥法计算贴壁的活细胞数及存活率,用倒置显微镜观察肝细胞形态变化。[结果]①不同浓度的藻毒索对大鼠肝细胞具有毒性作用,呈现出剂量一反应关系。②直接分离法可得到大量单个分散的肝细胞,细胞数量能够满足毒理学的实验要求,在41h内细胞生长较好,适于进行细胞毒理学的实验;65h后肝细胞功能和活力欠佳,不适于实验。[结论]微囊藻毒素对体外培养的肝细胞有毒性作用;直接分离法获取肝细胞进行原代培养的方法可用于短期细胞毒理学的实验研究。     

胚胎干细胞向肝细胞的诱导分化研究

胚胎干细胞在体外一定条件下能够分化为与原代培养肝细胞表型相似,并表达部分成熟肝细胞功能的类肝细胞.尽管目前在诱导条件的优化、分化过程的调控及临床应用的安全性等方面仍面临一系列问题,但研究胚胎干细胞向肝系的诱导分化及纯化,为终末期肝病的细胞移植治疗、生物人工肝及药物代谢和毒理研究提供了丰富的细胞来源.     

肝细胞培养系统在生物人工肝中应用的研究进展

近年来随着细胞培养技术的进步,肝细胞培养系统用于生物(混合)人工肝支持的研究发展迅速,已进入动物实验的最后阶段,并开始了临床应用的探索性研究,为临床肝衰竭的救治提供了良好的方法。本文对培养肝细胞在生物人工肝中应用的意义、研究进展、问题及展望进行了综述。     

溶血卵磷脂对L-20细胞SRBI表达的影响及辛伐他汀的干预作用

目的观察溶血卵磷脂(LPC)及辛伐他汀干预对体外培养人肝细胞(L-20)SRB I表达的影响。方法培养的肝细胞随机分为正常组、LPC损伤组及辛伐他汀组。分别用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫细胞化学和蛋白质免疫印迹(W esternb lot)方法观察肝细胞SRB I基因和蛋白表达的变化。结果LPC损伤组肝细胞SRB I基因和蛋白表达水平较正常组增强(P<0.05);辛伐他汀组肝细胞SRB I基因和蛋白表达水平均高于LPC损伤组(均P<0.05)。结论LPC损伤肝细胞后,SRB I基因和蛋白表达水平轻度上调;辛伐他汀干预可明显上调体外培养的肝细胞SRB I表达。这一作用有利于胆固醇的逆向转运及脂质代谢的改善。     

氟化物对原代培养大鼠肝细胞酶活力及超微结构的影响

目的研究不同剂量的氟化物对原代培养大鼠肝细胞存活率、酶活力及超微结构的影响。方法采用半原位胶原酶消化法分离大鼠肝细胞;MTT法检测细胞存活率;赖氏法检测培养液中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活性;透射电镜观察细胞超微结构改变。结果氟化钠染毒24小时后肝细胞存活率下降,且呈现明显的剂量-效应关系;2mmolL和4mmolL染氟组肝细胞培养液中ALT和AST的活性显著升高(P<005);透射电镜下染氟组肝细胞线粒体肿胀,内质网排列紊乱或断裂。结论过量氟化物对原代培养大鼠肝细胞有明显的毒作用,其主要作用方式是引起细胞膜和细胞器质膜损伤。     

硒拮抗氟对人肝细胞DNA损伤及凋亡的影响

目的　研究氟、硒对离体人肝细胞DNA损伤及凋亡的作用。方法　体外培养的人肝细胞分别接触一定剂量的氟和 /或硒 12h后 ,检测肝细胞DNA的损伤率、凋亡率和细胞周期构成比。结果　氟组肝细胞DNA损伤率、凋亡率和S期细胞数均明显高于对照组和氟 硒组 (P <0 0 5) ,硒组DNA损伤率和凋亡小体育分率均高于对照组 ,但无显著性差异 (P >0 0 5)。结论　一定剂量的硒可拮抗氟对离体人肝细胞DNA损伤及诱导的肝细胞凋亡作用     

间充质干细胞定向分化及其在肝脏疾病应用中的启示

间充质干细胞向肝细胞诱导分化成功后,分化后的肝细胞样细胞应用于肝病成为了研究热点。不仅未分化的间充质干细胞能治疗肝病,其来源的分化后的肝细胞样细胞亦能有效治疗肝病。因此,有必要对间充质干细胞分化前后的细胞治疗效果进行比较评价。本文从诱导分化培养方案、鉴定指标及相关细胞生物学功能进行述评。     

四氯化碳对肝细胞内钙,钙调蛋白信使系统的影响

本研究采用原代游离肝细胞培养技术,观察了CCl_4对肝细胞内游离钙浓度、钙调蛋白(CaM)、Ca~( )-Mg-ATP酶活性的影响。结果发现,低浓度的CCl_4对肝细胞内CaM的活性无明显影响,当培养液中CCl_4浓度增至0.96mg/ml时。肝细胞内CaM的活性明显下降,并随着作用时间的延长而下降趋势明显,呈明显的时间—效应关系。同时肝细胞内Ca~( )-Mg-ATP酶活性随之下降,细胞内游离钙浓度升高,培养介质中LDH的活性不断增加,培养介质中LDH活性与肝细胞内游离钙水平升高之间呈正相关(r=0.997,P<0.01)。表明CCl_4对肝细胞膜的损伤与其引起的钙稳态失调有关。肝细胞内CaM活性下降与肝细胞内CCl_4含量之间并无相关关系(r=0.122,P>0.05),提示CaM活性的降低并非CCl_4原形所致。     

急性乙醇暴露对人原代肝细胞血红素氧化酶的影响

目的　研究急性乙醇暴露对人原代肝细胞血红素氧化酶活力及蛋白水平的影响。方法　经体外灌流、分离培养人原代肝细胞 ,观察乙醇对人原代肝细胞上清液中天冬氨酸氨基转移酶 (AST)的释放及谷胱甘肽 (GSH)含量的变化 ,用westernblot方法检测乙醇对人原代肝细胞血红素氧化酶活力及蛋白水平的影响。结果　急性乙醇暴露导致人原代肝细胞上清液中释放的AST增加 ,并呈明显的剂量效应和时间效应关系 ;此外 ,在 10 0mmol L乙醇 2 4h暴露下 ,肝细胞中的GSH明显降低 ,而HO 1酶活力在 0 5～ 12h之间明显升高 ,随后开始降低 ,且HO 1蛋白水平变化趋势与此一致。结论　HO 1酶活力的升高可能与乙醇暴露下人原代肝细胞氧化损伤的保护有关     

血清浓度对高原体外肝细胞培养的影响

目的了解在高原环境条件下血清对培养肝细胞生长的影响,初步确定进行体外肝细胞培养的适宜血清浓度。方法采用已适应本地环境的成年家兔肝细胞进行体外单层培养,在常规RPMI1640培养基的基础上添加不同浓度的新生牛血清(0%、2%、10%及20%),观察培养细胞形态、数量及培养上清中白蛋白和尿素水平变化。结果无血清组始终未见明显细胞贴壁及增殖,其他组细胞均于接种4 h开始贴壁,8 h开始增殖,10%血清组和20%血清组细胞均于6 d生长满瓶,并形成均匀的单层,而2%血清组细胞则于8 d生长满瓶;2%血清组的细胞数量峰值明显低于10%血清组和20%血清组;除无血清组外,培养上清中白蛋白和尿素水平均呈现显著升高,其中10%血清组和20%血清组的白蛋白及尿素峰值水平明显高于2%血清组。结论在高原环境条件下,体外培养肝细胞的生长、增殖及其生物学功能维持明显依赖于常规基础培养基中添加的血清浓度;对于普通肝细胞培养实验而言,10%血清浓度较为适宜。     

大鼠肝细胞简易培养方法及某些生物学特性的研究

本文介绍一种改良的方法培养大鼠肝细胞,简便易行,可在一般条件的实验室开展,细胞活力良好,形态和超微结构正常,正常二倍体核型,可在体外存活达3个月,并对肝细胞生长过程中某些酶、蛋白质、激素、甘胆酸等作了生化、组化、放射免疫测定及6种微量元素的检测,同时进行了 HBV 感染体外培养肝细胞的试验。     

枯否细胞在大鼠烫伤早期肝损伤中的作用

目的：探讨枯否细胞在烧伤后对肝细胞的作用。方法：以30％Ⅲ度烫伤大鼠为模型，采用枯否细胞与肝细胞联合培养体系，检测培养上清中MDA、TNF、ALT、LDH的变化及添加TNF单抗的影响。结果：烧伤后活化的枯否细胞与正常肝细胞及烧伤后受损肝细胞联合培养组上清中ALT、LDH、MDA、TNF含量显著增高；在培养上清中加入TNF－α单抗后培养上清中TNF含量较对应组显著下降，但ALT、LDH却无明显改变。结论：烧伤后肠源性内毒素等可激活枯否细胞，而活化后的枯否细胞在体外亦能持续合成并分泌毒性介质（如氧自由基、TNF等），从而介导肝细胞的损害，且这种损伤作用对受损的肝细胞更明显；TNF对肝脏无直接损害效应，必须依赖于其他因素，如PMNs的存在。     

人肝细胞系L02胰岛素抵抗细胞模型的建立及鉴定

[目的]采用高浓度胰岛素体外诱导培养法建立人肝细胞IR模型,为研究IR的发生发展机制及筛选改善IR的药物提供一种简便可靠的IR细胞模型。[方法]以人肝细胞系L02为研究对象,在含5×10-7 mol/L人胰岛素的培养液培养16 h,未用高浓度胰岛素培养者为对照组。之后两组分别加入0、1、10、50、100、200 ng/ml人胰岛素。采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(GOD-POD)法检测培养液中残存葡萄糖含量。[结果]在各浓度的胰岛素刺激下,高胰岛素诱导组培养液中残存葡萄糖含量均显著高于对照细胞(P﹤0.01)。[结论]用含5×10-7 mol/L胰岛素的培养液培养16 h的L02细胞产生胰岛素抵抗,作为IR肝细胞模型可广泛用于胰岛素抵抗的研究。     

原代肝细胞模型的优化及苯乙烯和氧化苯乙烯的毒性研究

目的建立具有高活力、高功能特性的原代小鼠肝细胞模型,并通过该体外模型评价受试物苯乙烯和氧化苯乙烯的急性毒性。方法以BABL/C小鼠作为肝细胞供者,在经典两步胶原酶消化法基础上进行优化,通过逆向灌流、间断灌注、限制消化时间及Percoll液离心纯化的方式获取小鼠肝细胞,并进行体外单层和夹层培养;通过细胞形态、细胞活力、胞内糖原颗粒以及上清中各指标即白蛋白(ALB)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)及尿素氮(BUN)变化综合评价原代培养的肝细胞模型;以苯乙烯和氧化苯乙烯为受试物,用浓度分别为0.2、1、5、10和25μmol/L的受试物作用于夹层培养3 d的肝细胞,于染毒3、6、12、24及48 h后,采用CCK-8法和LDH法测定细胞存活率。结果改良法分离获取的小鼠肝细胞活力为(90.3±5.2)%,纯度为(95.3±4.2)%,产量达(2.4±0.9)×107;夹层培养7 d内90%以上细胞呈典型的肝细胞形态特征,培养第3 d胞浆内可见大量糖原颗粒。ALB分泌、LDH和ALT漏出、BUN合成、以及细胞活力夹层培养在8 d内、单层培养在6 d内呈波动性变化,且夹层培养法各指标明显优于单层培养法;夹层培养第3 d ALB分泌量[(1.42±0.20)g/L]和BUN合成量[(1.97±0.22)mmol/L]及细胞活力均达峰值,而LDH漏出量[(7.30±2.33)U/L]和ALT漏出量[(6.51±1.86)U/L]降到谷值,且3~7 d各指标变化相对稳定。苯乙烯和氧化苯乙烯在染毒6 h内,对肝细胞显示了较低的细胞毒性,细胞存活率在90%以上,且CCK-8和LDH两种毒性测定方法之间无显著差异;随着染毒时间的进一步延长,CCK-8法检测出的细胞存活率更低(85%以下),与LDH法相比差异有统计学意义。用不同浓度受试物处理肝细胞24 h后,从5μmol/L开始观察到相对较高的细胞毒性,用CCK-8法检测出细胞存活率约为85%,但与LDH法相比无显著差异;随着染毒浓度的继续增加,CCK-8法检测出的细胞存活率更低(80%以下),与LDH法相比差异有统计学意义。结论改良的胶原酶消化法结合夹层培养法可使肝细胞在较长时间(7 d)内维持良好的形态和功能,且用夹层培养3~7 d的肝细胞模型可以较准确地评价苯乙烯和氧化苯乙烯的毒性效应,结合毒性检测指标推测受试物主要影响肝细胞内线粒体亚细胞器的功能,对肝细胞膜的损伤程度影响较弱。     

CCl_4诱导大鼠原代肝细胞损伤模型的建立

目的:通过实验研究建立大鼠受损肝细胞的病理模型。方法:采用酶消化法分离大鼠肝实质细胞、进行体外培养,并建立四氯化碳(CCl4)体外诱导肝细胞损伤的模型,选择CCl4最适损伤浓度,进一步研究含药血清对体外肝细胞损伤的保护作用。结果:选取了CCl4造模的最佳浓度为9 mmol/L。结论:通过四氯化碳成功诱导了大鼠肝细胞损伤的模型。     

肝细胞微囊化技术及其在生物型人工肝中的应用进展

生物型人工肝的推广应用受限于缺乏足够数量的具有高度活性和良好功能的肝细胞。肝细胞微囊化为肝细胞大规模、高活性体外培养及长期冻存提供了一种可靠方法。微囊具有良好的生物相容性和合适的半透性,能保证肝细胞在微囊内长期存活,并维持正常的生理功能。本文就肝细胞微囊化技术及其在生物型人工肝的应用进展进行综述。