骨肉瘤细胞特异性结合短肽的筛选

目的：获得与骨肉瘤细胞株os-732特异结合的短肽，作为骨肉瘤靶向治疗的先导化合物。方法：以骨肉瘤细胞os-732为靶细胞，成骨细胞为吸附细胞对噬菌体12肽库进行差减筛选，用细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果：经三轮筛选，从随机挑选的20个噬菌体克隆中得到9个特异性与骨肉瘤细胞os-732结合，而不与正常成骨细胞结合的阳性克隆。但其氨基酸序列无同源性。结论：得到多个序列不同的特异性结合骨肉瘤的噬菌体克隆，提示骨肉瘤细胞表面结构复杂，具多个骨肉瘤抗原表位。本实验获得的短肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性，为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。     

人骨肉瘤细胞特异性结合肽的筛选及验证

目的获得人骨肉瘤细胞MG63特异性结合肽,为骨肉瘤靶向治疗奠定基础。方法应用噬菌体展示技术,以人骨肉瘤细胞作为靶细胞,293T细胞为差减细胞,筛选获得MG-63细胞特异性结合肽。酶联免疫法进行靶向性验证。应用荧光染色技术初步探讨短肽细胞受体位置。制作人骨肉瘤模型,尾静脉注射目标噬菌体,免疫组化检测其靶向性。结果经过四轮一步有机相离心分离方法,获得了与骨肉瘤细胞特异性结合的短肽,并测序获得其中出现次数最多的序列SLTNLSK,靶向验证结果显示该短肽有较强的特异性。结论应用噬菌体展示技术,获得了与人骨肉瘤细胞特异性结合的短肽,序列为SLTNLSK,并验证了其靶向性。可以作为骨肉瘤靶向治疗的导向性化合物。     

人骨肉瘤细胞特异性结合肽的筛选及验证

摘要：目的获得人骨肉瘤细胞MG63特异性结合肽,为骨肉瘤靶向治疗奠定基础。方法应用噬菌体展示技术,以人骨肉瘤细
胞作为靶细胞,293T细胞为差减细胞,筛选获得MG-63细胞特异性结合肽。酶联免疫法进行靶向性验证。应用荧光染色技术
初步探讨短肽细胞受体位置。制作人骨肉瘤模型,尾静脉注射目标噬菌体,免疫组化检测其靶向性。结果经过四轮一步有机
相离心分离方法,获得了与骨肉瘤细胞特异性结合的短肽,并测序获得其中出现次数最多的序列SLTNLSK,靶向验证结果显示
该短肽有较强的特异性。结论应用噬菌体展示技术,获得了与人骨肉瘤细胞特异性结合的短肽,序列为SLTNLSK,并验证了
其靶向性。可以作为骨肉瘤靶向治疗的导向性化合物。
     

CHO细胞表面与人CD59结合的活性短肽序列的筛选

目的筛选获得高表达人CD59中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表面与人CD59特异性结合的短肽序列,为下一步研究与肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽药物提供实验依据。方法以离子层析柱纯化的CHO细胞的裂解蛋白纯蛋白为靶分子分别进行5轮亲和筛选,并进行竞争结合实验,双夹心ELISA方法鉴定噬菌体阳性克隆。提取阳性单克隆单链DNA测序,并推导出短肽序列。结果随机挑选的16个单克隆中有10个克隆对CHO细胞纯蛋白有特异性结合力,经测序得到两条高度同源的多肽序列。结论通过噬菌体随机肽库对CHO细胞进行纯蛋白筛选得到了能与人CD59特异性结合的短肽序列。     

噬菌体随机肽库对肝癌细胞特异性结合短肽的筛选及鉴定

目的:通过噬菌体随机肽库,筛选人肝癌细胞结合短肽,并对其与肝癌细胞的特异结合能力进行生物学鉴定.方法:以L-02为阴性消减细胞,HepG2为靶细胞,对噬菌体随机七肽库进行4轮消减筛选.并随机挑取26个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析.以ELISA法鉴定噬菌体与HepG2细胞的结合活性.通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定H3噬菌体克隆与肝癌细胞结合的特异性.人工合成短肽HBP3,利用免疫荧光技术观察其与肝癌细胞的结合特异性.结果:4轮筛选使噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集.所挑取的26个阳性噬菌斑,经测序得到各噬菌体单克隆的多肽插入序列,最终产生5条氨基酸序列.经BLAST分析发现,在蛋白质数据库中未发现与这些短肽序列具有较好同源性的蛋白质分子.ELISA分析鉴定显示,5个阳性克隆在HepG2和L-02细胞上有差异性结合,其中H3噬菌体克隆对两种细胞的结合差异性最大.免疫细胞化学染色及免疫组织化学染色均显示,H3噬菌体克隆对肝癌细胞的结合靶向性明显高于对照细胞.免疫荧光显色证实,FITC-HBP3能特异性地结合于肝癌细胞的胞膜及核周胞质.结论:H3噬菌体克隆所呈现的七肽HBP3能与靶细胞高亲合性结合,为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础.     

噬菌体随机肽库中B型钠尿肽结合肽的筛选及鉴定

目的 利用噬菌体随机肽库筛选特异性靶向人肝癌细胞的短肽,为肝癌的靶向治疗提供理论依据.方法 以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,对噬菌体随机十二肽库进行3轮筛选.建立Hep62荷瘤裸鼠实验动物模型,并在裸鼠体内对经过体外3轮筛选的肽库再进行1轮筛选.随机挑取30个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析.通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定噬菌体展示肽的特异性.结果 经过3轮体外筛选和1轮动物体内筛选.噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集,随机挑选克隆测序结果表明十二肽VRKRSECLGAHD出现次数最多,免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色进一步证明该噬菌体能特异结合于肝癌细胞.结论 筛选得到的短肽能够特异性与肝癌细胞结合,为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础.     

噬菌体随机肽库筛选肝癌细胞特异性结合肽的实验研究

目的 利用噬菌体随机肽库筛选特异性靶向人肝癌细胞的短肽,为肝癌的靶向治疗提供理论依据.方法 以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,对噬菌体随机十二肽库进行3轮筛选.建立Hep62荷瘤裸鼠实验动物模型,并在裸鼠体内对经过体外3轮筛选的肽库再进行1轮筛选.随机挑取30个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析.通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定噬菌体展示肽的特异性.结果 经过3轮体外筛选和1轮动物体内筛选.噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集,随机挑选克隆测序结果表明十二肽VRKRSECLGAHD出现次数最多,免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色进一步证明该噬菌体能特异结合于肝癌细胞.结论 筛选得到的短肽能够特异性与肝癌细胞结合,为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础.     

噬菌体展示肽库筛选大肠癌细胞特异性结合肽的实验研究

目的 筛选人源大肠癌LoVo细胞株特异结合的短肽,作为大肠癌靶向治疗的载体.方法 以大肠癌LoVo细胞株作为靶细胞,人正常结肠黏膜上皮细胞为吸附细胞对噬菌体展示环七肽库进行差减筛选,采用细胞ELISA与免疫荧光检测鉴定噬菌体阳性克隆并测序.结果 对噬菌体展示环七肽库进行3轮筛选后,从随机挑取的20个噬菌体克隆中获得5个能与大肠癌LoVo细胞特异结合,而不与人正常结肠黏膜上皮细胞结合的阳性克隆,其氨基酸序列含有保守序列RPMP.结论 利用噬菌体展示肽库技术,可以成功筛选到大肠癌细胞的特异性结合肽,可能成为大肠癌靶向治疗的载体.     

可结合细胞表面IL-2Rα的短肽分子的筛选

目的利用噬菌体肽库技术筛选可特异性结合IL-2Rα的短肽序列，探索获得IL-2Rα小分子拮抗剂的可能性。方法以高表达IL-2Rα的MT-2细胞为钓饵。筛选噬菌体线性12肽库。用抗IL-2Rα单克隆抗体竞争洗脱结合的噬菌体，细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆，并测序。结果随机挑选的17个克隆中有7个可与MT-2细胞结合。免疫组化显示阳性噬菌体克隆M15可与MT-2细胞及PHA刺激的PBMC结合。根据阳性克隆DNA序列，推导出氨基酸序列，共有6种序列，富含亲水氨基酸并包含Tyr、Phe、Leu保守残基。结论得到含Tyr、Phe保守残基的序列，阳性序列可结合细胞表面的IL-2Rα。     

应用噬菌体肽库筛选Endoglin的结合肽

目的 利用噬菌体12肽库筛选可与Endoglin结合的活性小分子肽.方法 以rhEndoglin为靶分子,对噬菌体12肽库进行亲和筛选.经过3轮筛选,随机挑取16个克隆,双夹心ELISA法鉴定其亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体克隆的DNA序列,推断出与噬菌体外壳蛋白融合的氨基酸序列,竞争抑制实验检测优势克隆的特异性.结果 竞争性ELISA显示6个噬菌体克隆与rhEndoglin有较强的结合活性,经测序获得5种不同的多肽序列,其中2个克隆的氨基酸序列为:AHKHVHHVPVRL.结论 噬菌体随机肽库技术可以获得Endoglin结合肽的蛋白质序列.     

利用噬菌体肽库筛选可结合TNF—α的短肽序列

目的 对噬菌体环七肽库进行筛选。寻求可拮抗肿瘤坏死因子a(TNF-α）活性的小分子短肽。方法 以rhTNF-α为靶筛选噬菌体环七肽库，双夹心ELISA鉴定阳性克隆。结果 ELISA鉴定随机挑选经3轮筛选后所得23个噬菌体克隆发现，其中11个克隆显示与TNF-α有较强的结合，DNA测序发现其中两个克隆的氨基酸序列为：c-ALWHWWH-c,另9个克隆序列为：c-(T/S)WLHWWA-c。结论 噬菌体克隆展示肽能够模拟TNF-α受体或抗体的结合表位，为TNFα结合肽。     

脂多糖结合蛋白与CD14结合位点模拟肽的初步筛选

目的 应用噬菌体随机12肽库筛选脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)与CD14结合位点的多肽序列.方法 以CD14为固相筛选分子,对噬菌体12肽库进行4轮亲合筛选,采用酶联免疫吸附(ELISA)法鉴定筛选后的噬菌体克隆与CD14的结合活性,取结合活性较高的克隆进行DNA测序,推导其多肽序列并与LBP序列比对,再进行竞争抑制实验检测筛选噬菌体与LBP竞争结合CD14的效力.结果 挑取的20个噬菌体克隆中,16个结合实验鉴定阳性,取6个亲和力最高的克隆测序,得到3条不同编码的12肽序列(FHRWPTWPLPSP、MHRHPPPITLPL和AAFHRAHHLTSP),3条多肽与LBP一级结构同源性低,为模拟肽.6个噬菌体克隆有较高的竞争抑制率.结论 用噬菌体12肽库成功筛选出LBP与CD14结合位点的模拟肽.     

整合素αvβ3特异性结合肽的筛选及初步鉴定

目的 应用噬菌体随机肽库展示技术筛选能与整合素αvβ3分子具特异性结合功能的小肽分子,并对其功能进行初步鉴定.方法 根据整合素αvβ3分子细胞外配体结合区域的品体结构及蛋白质序列设计①～⑤号5条短肽,并作为筛选配基,分别经过3轮"吸附-洗脱-扩增"后,ELISA鉴定阳性克隆,DNA测序和分析,粘附试验进一步分析化学合成多肽的功能.结果 经3轮亲和筛选后,噬菌体克隆得到有效富集,以⑤号肽为代表,ELISA鉴定显示7个阳性克隆能与⑤号合成短肽有较强结合活性.进行DNA测序,多重序列分析获得2个多肽基序:****HRH,HWR****.粘附试验表明化学合成多肽FITC-HLPWHRH,FITC-HWRLHPH与表达整合素αvβ3的细胞株具有一定的亲和性,且结合能被αvβ3分子配体纤维连接蛋白所抑制.结论 通过噬菌体随机展示肽库技术在体外对合成的短肽进行筛选,可以获得与整合素αvβ3分子具特异性结合能力的小肽分子.     

从噬菌体展示肽库中筛选 PreS1抗原的结合肽

目的:从噬菌体随机七肽库中筛选能与PreS1抗原特异性结合的多肽。方法:利用噬菌体展示技术,以PreS1抗原为靶分子,从随机七肽库中进行生物亲和筛选,ELISA鉴定阳性克隆。结果:对肽库进行3 轮筛选后,通过ELISA和竞争抑制ELISA,获得了特异性的结合肽,测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列。结论:利用噬菌体展示技术成功筛选到了PreS1抗原的结合肽,为乙肝的治疗和诊断探索新的途径。     

短肽库中血管内皮细胞生长因子受体Flt-1拮抗剂筛选条件的改进

目的:改进噬菌体肽库的筛选条件,提高筛选阳性率及阳性克隆重复性.使血管内皮细胞生长因子受体Flt-1拮抗剂的筛选更为有效.方法:通过对血管内皮细胞生长因子受体Flt-1的原核表达产物的变性复性处理,获得相对纯化的可溶性Flt-1受体.将该可溶性受体固相化,对噬菌体表达12肽库进行4 ～ 5轮Bio-panning后,挑取单个噬菌斑制备高滴度噬菌体上清.用ELISA法初步鉴定各噬菌体克隆与sFlt-1的特异性结合并测定阳性克隆的DN A 顺序.在Bio-panning过程中增加非特异性蛋白的预吸附,并减少输入噬菌体数量, 再次筛选短肽库.结果:经过第一次筛选,获得了一系列具有一定重复性与同源性的噬菌体克隆. 改进筛选条件后,筛选阳性率由2%提高到8.3%,阳性克隆的重复性也得到显著提高.该高重复阳性克隆的氨基酸顺序与前一次筛选获得的阳性克隆有较高同源性.结论:Bio-panning 条件的改进提高了筛选效率,为不纯蛋白筛选短肽库积累了经验,并为血管内皮细胞生长因子受体拮抗剂的研制奠定了基础.     

噬菌体肽库在筛选及鉴定高转移性肝癌特异性结合肽中的应用及其意义

目的：探讨噬菌体环七肽库在筛选与肝癌高转移细胞株HCCLM3特异高效结合的短肽中的应用,为进一步探索肝癌转移的分子机制和寻找肝癌转移标志物奠定基础。方法：以人肝癌高转移细胞株HCCLM3为靶细胞、人肝癌低转移细胞株SMMC7721为吸附细胞对噬菌体环七肽库进行4轮差减筛选,采用ELISA方法进一步筛选出与HCCLM3细胞高度亲和的阳性克隆（即实验组A450nm值高于对照组3倍以上）,并利用免疫细胞化学方法鉴定噬菌体阳性克隆的特异性并测序。结果：经过4轮陶筛后,噬菌体在筛选靶细胞上出现明显富集,且逐轮提高（P<0.05）;利用ELISA法对筛选后随机挑取的20个噬菌体克隆进行初步鉴定,得到6个能与肝癌细胞HCCLM3亲和度较高的阳性克隆（C4、C6、C7、C10、C11和C17）;通过免疫细胞化学染色鉴定阳性克隆靶向肝癌细胞HCCLM3的特异性,与对照组比较,C7噬菌体对高转移潜能肿瘤细胞具有较高特异性（P<0.05）;测序显示6个阳性克隆氨基酸序列无同源性。结论：利用噬菌体环七肽库筛选得到与人肝癌高转移细胞株HCCLM3具有较高亲和力的多肽。