随机扩增多态DNA技术在地高辛标记HCMV DNA探针中的应用研究

应用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术结合地高辛非放射性标记系统制备了人巨细胞病毒ＤＮＡ探针，并与常规随机引物法进行对照。ＲＡＰＤ－ＰＣＲ制备的ＨＣＭＶＤＮＡ探针长度呈多态性，扩增过程中不需合成特异引物，探针特异性强，产量高，用５０ｎｇＨＣＭＶＤＮＡ模板即可制备８．０μｇ探针；标记体系中ＲＡＰＤ－ＰＣＲ方法Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ浓度为５．２％。表明ＲＡＰＤ－ΡＣＲ技术可用于少量ＤＮＡ模板制备大量ＤＮＡ探针，适用于原位杂交等需高浓度探针的核酸杂交及临床大量标本的测试，是一种经济方便的探针制备技术     

套式聚合酶链反应及限制酶分析对孕早期孕妇巨细胞病毒感染的研究

在人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）－ＡＤ１６９株直接早期基因的ＥｃｏＲＩＪ片段内，自行设计二对引物，建立套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）加限制酶分析检测ＨＣＭＶＤＮＡ，经实验证明有高度的特异性与敏感性，对其它疱疹类病毒及正常人基因组ＤＮＡ无交叉反应，一次性ＰＣＲ检测ＨＣＭＶ－ＡＤ１６９株基因组的最小检出量为１００ｆｇ，而套式ＰＣＲ可达１０ｆｇ，经ＰｓｔＩ酶切后，得到的片段与设计相符，对５８名孕早期孕妇外周静脉血     

套式PCR技术检测肝细胞癌患者血清HBV DNA

应用套式聚合酶链反应（套式ＰＣＲ）技术检测了１６例肝细胞癌（ＨＣＣ）患者血清中ＨＢＶＤＮＡ，并与ＰＣＲ结合Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交（ＰＣＲ－ＳＢＨ）的方法作了比较。２种方法灵敏度均可达１０￣（－５）ｐｇ。套式ＰＣＲ无需制备探针，试验周期短，更适于推广。１６例ＨＣＣ患者检出ＨＢＶＤＮＡ９例（５６．２５％）。ＨＢｓＡｇ阳性组９例检出４例，ＨＢｓＡｇ阴性组４例检出２例。３例未测ＨＢＶ血清标记物均检出ＨＢＶＤＮＡ。结果表明ＨＣＣ患者血清中仍有ＨＢＶＤＮＡ低水平复制，仍具传染性。     

双带PCR提高检测血清HBV—DNA质量的意义

应用双带ＰＣＲ方法（ＤＢ－ＰＣＲ）检测了２４０份血清中ＨＢＶ－ＤＮＡ。该方法能直接观察和判断假阴性和假阳性结果，提高了检测的准确性，与国内其它ＰＣＲ试剂比较，符合率分别为９４．０５％（ＤＢ－ＰＣＲ／华美产品）和９５．２８％（ＤＢ－ＰＣＲ／长城产品），ＨＢｅＡｇ阳性的血清，经ＤＢ－ＰＣＲ检测ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性者达９３．５５％（２９／３１）ＰＣＲ产物Ｓｏｕｔｈｅｍｂｌｏｔ后能与ＨＢＶ－ＤＮＡ探针杂交。     

应用PCR技术检测慢性乙肝病毒性肝病血清及外周血单个核细胞中HBV－DNA

本文应用多聚酶连反应（ＰＣＲ）技术检测了１０４例慢性乙肝病毒性肝病患者血清及外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中ＨＢＶ－ＰＮＡ，并与放免法进行了比较。结果显示，ＰＣＲ检测结果更能客观地反应ＨＢＶ在体内存在的状态，在外周血单个核细胞中有ＨＢＶ感染；１０４例慢性肝病患者外周血单个核细胞中ＨＢＶ－ＤＮＡ的检出率为２８．８％，而血清中ＨＢＶ－ＤＮＡ阴性的２０例患者有７例ＰＢＭＣ中检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ，占３５％。因此，在检测血清ＨＢＶ标志物及ＨＢＶ－ＤＮＡ的同时检测ＰＢＭＣ中的ＨＢＶ－ＤＮＡ可进一步防止ＨＢＶ传播与输血后肝炎的发生。     

HBV感染者外周血单个核细胞中HBV DNA的检测

目的；研究乙型肝炎毒（ＨＢＶ）感染者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）中ＨＢＶ ＤＮＡ的存在及其与血清ＨＢＶ ＤＮＡ的关系。方法：用ＰＣＲ法及斑点杂交法对５０例ＨＢｓＡｇ（＋）的感染者ＰＢＭＣｓ ＨＢＶ ＤＮＡ进行检测。同时用ＰＣＲ法检测感染者血清ＨＢＶ ＤＮＡ。结果：ＰＣＲ法和斑点杂交法分别从３５份和３２份ＰＣＭＣｓ检出率均为６０．０％左右。ＰＣＲ法检测血清ＨＢＶ ＤＮＡ阳性率为３６．０％。结论：Ｈ     

HBVDNA与HCVRNA同步扩增技术的建立与应用

同一份血清中的ＨＢＶＤＮＡ与ＨＣＶＲＮＡ经热变性直接法一步裂解，先用针对ＨＣＶ特异的外引物将ＨＣＶＲＮＡ逆转录为ｃＤＮＡ，然后采用ＨＢＶ，ＨＣＶ各自特异的２套引物进行ＰＣＲ同步扩增。结果按预定大小，ＰＣＲ产物出现２条带。分别为４２８ｂｐ，１４４ｂｐ。将产物转移至尼龙膜上，经α－３２ＰｄＣＴＰ标记ＨＣＶ探针及地高辛素标记ＨＢＶ探针进行重复杂交，证明１４４ｂｐ为ＨＣＶ所特有，４２８ｂｐ为ＨＢＶ特有。用该方法对３０份单独检测证实ＨＢＶ，ＨＣＶ核酸均阳性血清测验，其结果完全吻合、该二联技术可明显缩短检测时间，具有简便、快速、敏感的特点。     

用聚合酶链反应检测乙肝患者血清中的HBV－DNA

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测了１１４例传染科门诊病人血清ＨＢＶ－ＤＮＡ，并与ＨＢＶ有关的血清学标志（ＨＢＶＭ）进行了比较。结果表明：在９２和ＪＨＢｓＡｇ（＋）病例中，ＰＣＲ检测ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性者５０例，占５４．３４％；在２８例ＨＢｅＡｇ（＋）病例中，ＰＣＲ检测ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性者２６例，占９２．８６％；在２０例ＨＢＶＭ均为阴性的病例中，ＰＣＲ检测ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性者有６例，占３０．００％。证明ＰＣＲ法检测ＨＢＶ－ＤＮＡ较用ＥＬＩＳＡ法检测抗原一抗体更加灵敏、可靠。     

地高辛标记DHBVDNA探针的制备及应用

采用随机引物法制备地高辛标记含鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）基因片段的质粒ＰＢＲ３２２作为探针，建立ＤＨＢＶＤＮＡ斑点杂交试验，结果：探针可检出１．０ｐｇ同源ＤＮＡ片段，不与人乙肝病毒（ＨＢＶ）及鸭肝细胞ＤＮＡ发生杂交，与￣３５Ｓ－ＤＨＢＶＤＮＡ探针的灵敏度相似。该探针检出重庆地区２－３月龄麻鸭血清ＤＨＢＶ自然感染率为２５．４８％；用ＤＨＢＶ血清经腹腔感染１－２日龄雏鸭，１周后阳性感染率为８２．９０％，并可持续感染至少２月。     

Lumiget PPD化学发光法检测HCMV DNA

在ＤＩＧ标记及检测系统中，以Ｌｕｍｉｇｅｔ ＰＰＤ作为ＡＰ底物，经ｄｏｔ－Ｂｌｏｔ杂交后进行化学发光法检测ＨＣＤＭＶ ＤＮＡ，并与ＮＢＴ义物显色法比较，结果显示：Ｌｕｍｉｇｅｔ ＰＰＤ法可检出０．１Ｐｇ，同源ＤＮＡ，非同源性ＨＢＶ ＤＮＡ，ＨＳＶ－Ⅰ，ＨＳＶ－Ⅱ，ＤＮＡ不能检出；Ｌｕｍｉｇｅｔ ＰＰＤ底物作用只需３ｈ即可获得清晰稳定的结果，优于ＮＢＴ底物显色法。     

荧光定量PCR技术在检测HCV—RNA中的应用

目的 评价荧光定量ＰＣＲ技术测定ＨＣＶ－ＲＮＡ水平的价值,探讨ＰＢＭＣ中检出ＨＣＶ－ＲＮＡ的意义。方法 采用荧光定量ＫＲ及ＲＴ－ＰＣＲ技术同时检测８７例血液透析患者的血清和淋巴细胞中ＨＣＶ－ＲＮＡ。结果血清、淋巴细胞中ＨＣＶ－ＲＮＡ的荧光定量ＰＣＲ检出率（４９．４％、６９．０％）,分别高于相应标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ的ＲＴ－ＰＣＲ阳性率（３３．３％、３５．６％）（Ｐ ＜０．０５）。血清、淋巴细胞中同时检出ＨＣＶ－ＲＮＡ的一致率,荧光定量ＰＣＲ法（３１．０％）显著高于ＲＴ－ＰＣＲ定性法（６．９％）（Ｐ＜０．００１）． 荧光定量ＰＣＲ法,淋巴细胞中ＨＣＶ－ＲＮＡ检出率高于血清（Ｐ＜０．０１）。结论 与 ＲＴ－ＰＣＲ相比,荧光定量ＰＣＲ技术检测 ＨＣＶ－ＲＮＡ敏感性较高,对ＰＢＭＣ内ＨＣＶ－ＲＮＡ检测有利于提高ＨＣＶ检测的阳性率。     

抗CD4单克隆抗体可变区基因克隆及测序

目的：获取抗ＣＤ４单克隆抗体（ＭｃＡｂ）可变区基因，为构建抗ＣＤ４嵌合抗体打下基础。方法 从分泌抗人ＣＤ４ ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞系中提取总ＲＮＡ，用家族特异性引物进行逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），分别扩增出重链可变区（ＶＨ）基因及轻链可变区（ＶＬ）基因。将ＰＣＲ产物克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体，然后转化ＪＭ１０９细菌。并用全自动 ＤＮＡ序列分析仪对ＶＨ及ＶＬ基因序列进行测定。结果：ＶＨ基因为３５１     

应用聚合酶反应制备HBV DNA生物素探针

通过聚合酶链反应将Ｂｉｏ－１１－ｄｕＴＰ掺入扩增的ＨＢＶ ＤＮＡ中，制备了长度为１２０ｂｐ的生物素探，检测到０．１ｐｇ的ＨＢＶ ＤＮＡ。ＰＣＲ标记法简便迅速，特异性，用ＤＮＡ量少且无需分离纯化，其标记探针得率高，活性强。     

应用聚合酶链反应检测乙肝患者外周血单个核细胞HBV.DNA的研究

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测６０例乙型肝炎患者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）及血清ＨＢＶ．ＤＮＡ阳性率分别为７６．７％和４５％，尤其在急性乙肝（ＡＨ）或抗ＨＢｅ阳性或抗ＨＢｓ阳性的患者中，ＨＢＶ．ＤＮＡ在ＰＢＭＣ中检出率显著高血清，提示ＨＢＶ．ＤＮＡ普遍存在乙肝患者甚至ＨＢｓＡｇ转阴的病人ＰＢＭＣ中，可能是肝脏病病变反复活动及病毒重复感染的来源。因此也导致既往有ＨＢＶ感染史的ＨＢｓＡｇ阴性献血员传     

乙肝病毒PCR产物的鉴定及单项抗HBc阳性血清的HBV基因扩增

本文报道ＨＢＶ基因扩增产物的限制性酶切分析和寡核苷酸探针杂交鉴定、应用血清ＨＢＶＤＮＡ的ＰＣＲ扩增产物制备基因探针和单项抗ＨＢｃ阳性血清的ＨＢＶ基因扩增。ＰＣＲ用ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｗ３种亚型ＨＢＶ的Ｃ基因区共有序列为内外两对引物分单次或套式扩增，产物为６６ａｂｐ或４２８ｂｐ，两者序列中段共含－ＢｇＩⅡ酶切点并与一寡核苷酸探针同源。４２８ｂｐ产物被用以缺口平移标记３２Ｐ探针作斑点和转印杂交检测。结合分子杂交的ＰＣＲ结果从单项抗ＨＢｃ阳性的８／４２例慢性肝炎和２／１２例无症状受测者血清中检出ＨＢＶＤＮＡ，证实病毒低度复制和传染性。     

HBx—DNA探针的研制及在肝癌发生机制研究中的应用

将非放射性标记物地高辛甙元用随机引物法由ｐＢＲ３２２－２ＨＢＶ／ＥｃｏＲ Ｉ酶切片段（３．２ｋｂ）制备ＨＢＶ－ＤＮＡ探针及由ＨＢＶ／ＢａｍＨ Ｉ、Ｂｇｌ Ⅱ酶切片段（０．５９ｋｂ）制备ＨＢｘ－ＤＮＡ探针。将Ｄｉｇ－ＨＢＶ ＤＮＡ探针用斑点杂交、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转膜杂交检测筛选肝细胞性肝癌ＨＢＶ－ＤＮＡ整合型标本，进而用Ｄｉｇ－ＨＢｘ ＤＮＡ探针检测ＨＢＶ－ＤＮＡ纯整合型肝细胞性肝癌中ＨＢｘ的存在情     

Wistar雄性大鼠DNA基因组的多态性分析

使用一种随机引物“Ｐ２（ＣＧＧＣＣＧＧＴＡ）对正常Ｗｉｓｔａｒ雄性大鼠ＤＮＡ基因组进行ＲＡＰＤ－ＰＣＲ分析，扩增产物呈现出多态性ＤＮＡ图谱，其中ＤＮＡ片段分子大小依次为：１４３９、１３３４、１１２２、７０８、５７５、５３７、４７９、３１６ｂｐ。ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术简便、快速。     

用套式PCR检测新生儿先天性巨细胞病毒感染

选取ＨＣＭＶＡＤ１６９株ＥｃｏＲＩＪ片段区的ＩＥＡ基因第四外显子为扩增靶序列，合成两对引物，外引物扩增２４２ｂｐ片段，内引物扩增１４６ｂｐ的片段，此方法很灵敏，可检测５－１０ｆｇＨＣＭｖＤＮＡ。我们随机采集５１名新生儿脐带血，应用ＮａＩ法提取全血ＤＮＡ为模板进行扩增，结果表明：３２名为ＨＣＭＶＤＮＡ阳性，以口腔粘液ＤＮＡ（４０名）为模板进行扩增，２４名为ＨＣＭＶＤＮＡ阳性。因此，套式ＰＣＲ可用于临床上快速准确地检测ＨＣＭＶ。     

人原发性肝细胞癌地高辛素标记HBV DNA探针的原位杂交与C－myc和P_（53）癌基因表达相互关系的研究

取自肝癌高发区的４０例人原发性肝细胞癌（ＰＨＣ）标本，应用地高辛素（Ｄｉｇ）标记ＨＢＶＤＮＡ探针作原位杂交，检测ＰＨＣ和癌周肝组织内ＨＢＶＤＮＡ的表达，并用光敏生物素Ｃ－ｍｙｃ癌基因探针原位杂交和用免疫组化检测ＨＢｓＡｇ，ＨＢｃＡｇ及Ｐ５３癌基因在ＰＨＣ和癌周肝组织内的表达。Ｄｉｇ－ＨＢＶＤＮＡ探针肝内总阳性率为８０％，在ＰＨＣ内为６５％，而癌周肝组织中为７３％。ＨＢＶ－ＤＮＡ定位于肝细胞或癌细胞的胞浆和胞核内，而ＨＢＶＤＮＡ阳性颗粒在胞浆内比胞核内多。ＨＢＶＤＮＡ阳性细胞癌周比癌内更多。结果表明，ＰＨＣ病例与ＨＢＶ存在关系密切；癌内ＨＢＶＤＮＡ大都属整合型，而癌周属游离型。研讨ＰＨＣ内ＨＢＶＤＮＡ的表达与ＨＢｓＡｇ，ＨＢｃＡｇ，和Ｐ５３及Ｃ－ｍｙｃ癌基因的表达相互关系及致癌作用。     

PCR检测HBV－DNA对探讨肝癌病因的意义

为探讨乙肝病毒复制标志物在原发性肝细胞癌（ＨＣＣ）发生中的病因学意义，我们应用多聚酶链反应（ＰＣＲ）方法检测了启东、泰兴１４０例ＨＣＣ病例和２４７例对照的血清乙型肝炎病毒ＤＮＡ（ＨＢＶ－ＤＮＡ），并结合其它乙肝病毒指标，分析了ＨＢＶ－ＤＮＡ在ＨＣＣ发生中的病因学作用。结果显示：ＰＣＲ方法检测血清ＨＢＶ－ＤＮＡ的灵敏度和特异度均较高，在探讨ＨＣＣ的病因中具有重要的应用价值；Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归分析也显示：ＨＢＶ－ＤＮＡ复制为ＨＣＣ重要的病因标志之一，明显优于其它复制指标，其ＯＲ值和人群归因危险度（ＰＡＲ）值分别为２．１１和４９％，虽不如ＨＢｓＡｇ感染的危险性大，但仍可见其独立地在ＨＣＣ发生中的病因学作用。