CA16疫苗候选株特异性免疫血清保护性的初步评价

目的评价CA16 K168/8疫苗候选株免疫血清对不同CA16毒株的交叉中和能力及对致乳鼠麻痹CA16临床分离株的体内中和保护能力。方法将CA16 K168/8疫苗候选株病毒纯化液辅以弗氏佐剂经背部及侧腹部皮下多点注射免疫新西兰大白兔,制备高效价免疫血清。采用微量细胞病变法检测中和抗体效价;用中和抗体效价终浓度为32 U的特异性免疫血清对18株不同CA16临床分离毒株及15株EV71毒株进行交叉中和指数检测;选取中和抗体效价为16、32、64、128、256 U的特异性免疫血清对可致乳鼠产生明显麻痹作用的CA16 FY-18株进行体内中和保护水平检测。结果获得的兔抗CA16 K168/8血清对14株CA16毒株的中和效价为1∶1 024~1∶6 144,GMT值为1∶3 153;可于体外完全中和18株不同CA16毒株,中和指数为100~5 623.4,平均值为794.1,而对15株EV71临床分离株中和指数仅为0.32~5.62,平均值为2.2;体内中和保护水平随抗体效价升高而增加,呈量-效关系,当中和抗体效价达128 U时,可完全保护乳鼠不发生临床麻痹反应。结论 CA16 K168/8疫苗候选株特异性免疫血清体内、外试验结果表明其具有良好的免疫保护性。     

发热伴血小板减少综合征疫苗株免疫原性比较

目的比较重症发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)疫苗株AH12和JS2011-013毒株的免疫原性及其疫苗原液的免疫原性。方法用灭活前滴度相同的AH12和JS2011-013株病毒免疫BALB/c小鼠,设佐剂组(铝佐剂终浓度为1 mg/mL)及非佐剂组,比较相同免疫剂量下,14、28及42 d诱导产生的中和抗体效价;用含有相同Gn抗原量的AH12和JS2011-013株疫苗原液免疫小鼠,比较相同免疫剂量下,14、28及42 d诱导产生的中和抗体效价。结果 AH12和JS2011-013毒株以灭活前相同滴度或相同Gn抗原含量的条件下分别免疫小鼠,AH12毒株产生的抗体效价较高,免疫原性较强;佐剂的添加对于毒株免疫原性有增强作用。结论 AH12毒株的免疫原性强于JS2011-013毒株。     

柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus group A type 16,CA16)VP1蛋白,并检测其免疫原性。方法通过RT-PCR法从CA16病毒青岛株中扩增VP1基因,克隆至原核表达载体pET43.1a(+)中,构建重组表达质粒pET43.1a-VP1,转化感受态E.coli Rossatte(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组CA16 VP1蛋白通过Ni柱亲和层析纯化后,采用不同剂量(5、10、20、40μg)免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价,微量细胞病变抑制法检测血清中和抗体效价。结果重组表达质粒pET43.1a-VP1经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组CA16 VP1蛋白相对分子质量约为34 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的15%;纯化的重组CA16 VP1蛋白纯度可达95%以上,可与猴CA16抗血清反应;不同剂量的重组CA16 VP1蛋白免疫BALB/c小鼠,可诱导产生CA16特异性抗体,血清中总IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价均明显高于对照组,且抗体效价与免疫剂量存在一定的量效关系;各剂量CA16 VP1组免疫小鼠血清中和抗体效价均小于1∶8。结论已成功在大肠杆菌中表达了重组CA16 VP1蛋白,纯化的重组蛋白可诱导小鼠特异性体液免疫应答,为进一步研究CA16的结构、功能及相关疫苗的研制奠定了基础。     

柯萨奇病毒A组16型实壳病毒颗粒与空壳病毒颗粒免疫原性的比较

目的比较柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)实壳病毒颗粒(full particle,FP)和空壳病毒颗粒(empty particle,EP)的免疫原性。方法以CVA16病毒株CVA16-L731感染Vero细胞,采用10层细胞工厂培养工艺培养病毒,收获液经离心纯化后,用甲醛灭活,获得灭活纯化的CVA16-L731 FP和EP。采用BCA法检测CVA16-L731 FP和EP的蛋白浓度,4%~12%SDS-PAGE、Western blot及透射电镜对CVA16-L731 FP和EP进行鉴定。以氢氧化铝为佐剂,分别以EP、FP、EP/FP为抗原,于第0、14、28天经后肢肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,于0、7、21、35、49、63、77、91 d对小鼠进行眼眶采血。采用微量中和试验法检测免疫小鼠血清中和抗体滴度,ELISA法检测免疫小鼠血清特异性Ig G抗体滴度,母传抗体保护试验检测CVA16-L731 FP和EP的垂直保护效果。结果纯化后的CVA16-L731 FP和EP的蛋白浓度分别达到420和150μg/ml;CVA16-L731 FP可见4条相对分子质量分别约为34 000(VP1)、26 000(VP2)、24 000(VP3)和8 000(VP4)的条带,CVA16-L731 EP可见3条相对分子质量分别约为36 000(VP0)、34 000(VP1)和24 000(VP3)的条带;CVA16-L731 FP和EP的纯度均可达95%;CVA16-L731 VP1兔多抗可与FP及EP的VP1、CVA16-L731 VP2兔多抗可与FP-VP2及EP-VP0发生特异性免疫反应;CVA16-L731FP和EP分别为内部不可被磷钨酸负染的FP致密圆形颗粒和内部可被磷钨酸负染的黑色EP圆型颗粒。小鼠免疫试验结果显示,第1次免疫后各抗原免疫组小鼠血清中和抗体阳性率均为100%;第2次免疫后血清中和抗体滴度和血清特异性Ig G水平均显著升高;第3次免疫后血清中和抗体滴度均无明显变化,但血清特异性Ig G水平均明显升高;第3次免疫后的63 d内,血清中和抗体滴度均无显著变化。各抗原免疫组乳鼠存活率均为100%。结论CVA16-L731 FP和EP均能诱导小鼠持续产生较高水平的血清中和抗体和特异性Ig G抗体,且母传抗体可保护2日龄乳鼠抵抗CVA16-S315的致死性攻击,为CVA16疫苗的研制提供了实验依据。     

狂犬病毒街毒株糖蛋白基因克隆、测序与表达

经实验研究证明狂犬病毒街毒株SBD0 7株具有较好的免疫原性后 ,通过RT PCR法 ,克隆了该毒株的糖蛋白 (G)基因 ,并进行了全序列测定。结果表明该株狂犬病毒G基因与疫苗株 (aG株 )的核酸及蛋白同源性分别为 85 8%和 88 5 %。以痘苗病毒为载体成功地表达了该基因 ,经小鼠实验表明能诱生较高滴度的狂犬病毒中和抗体 ,并能保护狂犬病毒致死量的攻击     

人禽流感裂解疫苗对小鼠的免疫原性观察

目的观察人禽流感裂解疫苗对小鼠的免疫原性。方法将不同血凝素含量(20、30、45μg/ml)的铝佐剂和无佐剂人禽流感裂解疫苗各3批分别经腹腔注射免疫小鼠,0.5 ml/只,每批疫苗又分为1针、2针和3针组,每组10只,每针间隔1周,同时设空白对照组。首针免疫后21 d,分别采血,分离血清,检测血凝抑制抗体效价和中和抗体效价。结果 1针、2针组各3批无佐剂疫苗免疫小鼠的血凝抑制抗体效价和中和抗体效价分别小于1∶40和1∶200;2针、3针组各3批铝佐剂疫苗的血凝抑制抗体效价均大于1∶50,2针组20、30μg/ml血凝素铝佐剂疫苗的中和抗体效价均大于1∶200;2针、3针组20、30与45μg/ml血凝素铝佐剂疫苗的血凝抑制抗体效价和中和抗体效价差异均无统计学意义(P>0.05);且2针、3针组3批铝佐剂疫苗的血凝抑制抗体效价和中和抗体效价均明显高于相应的3批无佐剂疫苗。结论铝佐剂疫苗对小鼠的免疫原性明显优于无佐剂疫苗,且20、30μg/ml血凝素铝佐剂疫苗接种2针可获得理想的免疫效果。     

口蹄疫病毒VP1、VP4基因核酸疫苗质粒的构建及其免疫原性

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)VP1、VP4基因核酸疫苗质粒,并研究其免疫原性。方法通过RT-PCR获得FMDVVP1、VP4基因,以真核表达载体pIRESneo为基础,构建VP1单表达以及VP1、VP4融合表达和共表达质粒。转染BHK-21细胞后,Western blot检测目的蛋白的表达。将上述3种基因核酸疫苗、VP1单表达与VP4单表达联合疫苗、灭活疫苗和空载体对照免疫豚鼠,检测血清特异性抗体及中和抗体水平,并进行保护力试验。结果VP1单表达,VP1、VP4融合表达及共表达质粒经PCR及酶切鉴定,证明构建正确。各组核酸疫苗质粒均能诱导产生中和抗体,且具有一定的保护效力。VP1单表达组和联合组保护率均为28.6%;共表达组和融合表达组保护率均为42.9%;灭活疫苗组保护率为100%;空载体组保护率为0。结论口蹄疫病毒VP1与VP4共存时能发挥更好的免疫原性。     

肠道病毒71型中和抗体的保护水平

目的通过检测乳鼠模型、健康婴幼儿和疫苗免疫后目标人群的肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)中和抗体效价,为确定EV71疫苗保护水平提供基础数据。方法 6份不同EV71病毒株免疫血清经中和抗体准确定量后,分别通过两个EV71乳鼠攻毒模型,检测EV71中和抗体保护水平。采用标准化的中和抗体检测法和EV71中和抗体定值标准品,分别对健康婴幼儿及疫苗免疫后血清进行中和抗体准确定量。结果在2个乳鼠攻毒模型中,6份免疫血清的中和抗体保护水平接近,ED50分别为10～50 U和6.1～54.2 U;婴幼儿人群7、12和24月龄抗体阳性率分别为45.0%、48.8%和56.8%,阳性人群的抗体效价分别为113.8、120.3和330.6U/m(l均值为173.2 U/m)l,母亲抗体阳性率和效价分别为86.7%和114.3 U/ml;中、高剂量疫苗2针免疫后,婴幼儿抗体阳性率均为100%,效价为356.0和1 136.2 U/ml,较婴幼儿人群自然感染水平高2.1～6.6倍。结论应用标准化的中和抗体检测法和EV71中和抗体定值标准品,确定了以U/ml为单位的乳鼠攻毒抗体保护水平及婴幼儿人群抗体水平和疫苗免疫后抗体水平,为EV71疫苗免疫人群中和抗体保护水平的确定提供了依据。     

人肠道病毒71型中和抗体检测方法的实验室评价

目的对人肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)中和抗体检测方法进行实验室评价,为该方法的标准化提供依据。方法 5个实验室按照统一制定的EV71中和抗体检测操作细则(SOP),应用A、B和C基因型的10株EV71病毒株,分别测定10份人免疫球蛋白、20份健康成人血浆和15份EV71动物高效价免疫血清样品中EV71中和效价,检测实验室内、实验室间重复性及不同EV71病毒株对中和抗体检测的影响。结果相同实验室应用各病毒株重复测定中和效价的最大值与最小值(Max-Min)倍数差均在4倍以内,3次重复试验结果间差异无统计学意义(P值均>0.05);不同实验室应用相同病毒株检测结果的Max-Min倍数差在4倍以内;不同实验室应用不同病毒株检测结果为:A型株与其他基因型病毒株中和效价的Max-Min差在192倍以内,B3与C4亚型的病毒株中和效价的Max-Min倍数差在64倍以内,C4亚型不同病毒株之间中和效价的Max-Min倍数差在16倍以内。结论按统一SOP操作后,EV71中和抗体检测方法应用相同毒株在实验室内和实验室间具有较好的重复性,而不同病毒株对中和效价的测定结果有较大影响。     

我国狂犬病流行毒株JX08-45适应细胞培养后的生物学特性

目的鉴定我国狂犬病流行毒株JX08-45适应细胞培养后(命名为JX08-45CC株)的生物学特性。方法通过全基因组序列分析比对、小鼠脑内和外周攻毒试验和免疫原性试验,分别对JX08-45CC株的基因组特点、毒力和免疫原性进行鉴定。结果 JX08-45CC株的基因组序列与JX08-45株比对,共出现16个核苷酸突变点和7个氨基酸突变点,其中6个氨基酸变异发生在G蛋白(333位精氨酸未改变)编码区,L蛋白仅有1个氨基酸突变;在G蛋白氨基酸变异中,4个突变序列在其他细胞适应毒株CVS-11、CTN-1、Nishigahara、SAG2、Flury-LEP和SRV9中也普遍存在。JX08-45CC株培养滴度≥107TCID50/ml时,脑内接种小鼠的致死率为100%,滴度为102～106TCID50/ml时,脑内接种小鼠的致死率为20%～80%;滴度为105～108TCID50/ml时,外周肌肉接种小鼠,致死率为10%～70%;脑内和外周攻毒小鼠的潜伏期均为7～9 d,并于发病后24～48 h死亡。JX08-45CC株与狂犬病病毒CVS-11、ERA、SRV9和Flury-LEP株的中和抗体滴度差异均无统计学意义(P>0.05)。结论已对JX08-45CC株的基因组序列、毒力和免疫原性等生物学特性进行了鉴定,为开发具有我国自主知识产权的兽用狂犬病灭活疫苗候选株奠定了基础。