急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因的临床研究

目的 研究急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因的亚型、变化及其临床意义。方法 采用筑巢式逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)技术,检测初治APL患者PML-RARα融合基因,监测完全缓解者微小残留病灶。结果 32例初治APL患者PML-RARα融合基因均为阳性(100%),其中S型为25%,L型为75%。L型的复发率及早期病死率分别为12.5%、12.5%,显著低于S型的复发率及早期病死率(25%和37.5%)。L型患者的预后比S型患者好。采用全反式维甲酸(ATRA)及小剂量高三尖杉酯碱诱导治疗,缓解后分别用化疗与维甲酸交替进行强化治疗,使PML-RARα阳性率随缓解期的延长而逐渐降低。同时监测16例APL缓解患者,PML-RARα融合基因阴性患者可长期生存。结论 PML-RARα融合基因的检测对APL的确诊、预测预后具有重要的临床意义。     

急性早幼粒细胞白血病PML—RARα融合基因检测的临床意义探讨

目的探讨PML-RARα融合基因检测在临床检查急性早幼粒细胞白血病（APL）治疗前后的意义。研究PML—RAR饯融合基因含量与急性早幼粒细胞白血病（APL）病变进程的关系。方法运用RT-PCR技术检测急性早幼粒细胞白血病患者治疗前后骨髓内PML-RARα融合基因含量。结果所有51例初诊为APL的患者均做PML—RARα融合基因检测,其中阳性4l例,阳性率为80．4％。初诊为APL的51例患者治疗18个月后（进行随访）,其中死亡3例,阳性3例,阳性率为5．9％。结论PML-RARα融合基因的检测对APL诊断具有重要价值。定期检测PML—RAR仅基因可尽早发现分子学复发以及时治疗,并避免血液学复发。     

全反式维甲酸诱导分化急性早幼粒细胞白血病客观疗效评估的建议

由于对全反式维甲酸(ATRA)诱导分化治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)的缓解疗效及开始向化疗移行日期的判断尚有困难,作者对18例APL患者治疗中骨髓像、染色体及基因分析[RARα重排,PML-RARα微小残留病(MDR)]作了连续的检测,以探讨ATRA     

实时定量RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因方法的建立

目的 建立用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测急性早幼粒细胞白血病(APL)PML-RARα mRNA的方法.方法 制备目的基因PML-RARα的RNA标准品及管家基因β-actin的RNA标准品.然后将目的基因PML-RARα和管家基因β-actin的标准品梯度稀释作为模板进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线.利用成功构建的两个标准曲线测定APL患者的目的基因PML-RARα与管家基因β-actin的相对值,分析不同状态患者的微小残留病(MRD)水平是否有差别,从而指导临床的治疗.结果 用本研究建立的实时定量RT-PCR方法可检测出10～5 μg NB4细胞cDNA中的PML-RARα融合基因,其重复性的循环域值(Ct值),管间、批间变异系数(CV)分别为2.2%、4.0%.结论 本研究所建立的实时定量RT-PCR方法灵敏度高、重复性好.应用本法检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因表达水平的改变,有助于监测白血病微小残留病,评价疗效及判断预后.     

一步法RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因

目的 建立一步法RT-PCR检测急性平幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者PML-RARα融合基因的实验方法并作相关性能评价.方法 设计两对特异性引物,用一步法RT-PCR法检测APL患者PML-RARα融合基因的三种异构体,并用NB4阳性细胞株做稀释试验,得出该方法 的最低检测限;同时对2006年以来华西医院确诊APL患者的PML-RARα融合基因检测和骨硅细胞形态学检查结果进行比较.结果 一步法RT-PCR法检测PML-RARa 融合基因的灵敏度可迭10-4水平;使用两对引物同时扩增,可检出PML-RARα融合基因全部三种异构体;62例经临床和骨髓形态学确诊为APL的患者,其PML-RARα融合基因阳性率为100%.结论 一步法RT-PCR检测APL患者PML-RARα融合基因有很好的灵敏度,临床符合度较高且操作简便快速,样本交叉污染可能性小,临床实用性较高.     

实时定量聚合酶链反应在急性早幼粒细胞白血病融合基因检测中的临床应用

目的 比较不同类型的逆转录荧光实时定量聚合酶链反应（RQ-PCR）检测急性早幼粒细胞白血病（APL）PML-RARα融合基因的方法.方法 建立荧光染料SYBR Green Ⅰ和Eva GreenRQ-PCR技术,同时检测56例APL融合基因PML-RARα的表达水平,并且与传统巢式PCR方法进行敏感度比较.选择10例初诊患者随机分为两组,分别给予维甲酸（ATRA）加化疗或ATRA加三氧化二砷治疗.每3周抽取骨髓标本,检测治疗后PML-RARα表达的变化.结果 两种RQ-PCR的灵敏度均可达到50拷贝,稍低于巢式PCR,但RQ-PCR定量准确,不易污染.分别取10^3拷贝和10^7拷贝的PML-RARα质粒以及患者cDNA同时做8次SYBR-Green Ⅰ平行扩增,批内变异系数分别为7.31%、8.26%和5.02%.不同APL患者PML-RARα表达水平有较大差异,初诊患者PML-RARα/GAPDH比值介于0.018～0.799,中位值为0.070;使用这两种染料建立的RQ-PCR方法进行定量检测,荧光染料Eva-Green荧光强度高于SYBR GreenⅠ 4倍.对接受ATRA加化疗或ATRA加三氧化二砷治疗两种不同治疗方案的APL患者动态观察发现,2～4周PML-RARα转录本均迅速减少,2个月后80%PML-RARα转阴,但两种治疗方式无明显差异.结论 RQ-PCR可以准确检测微小残留病（MRD）融合基因表达水平;Eva Green和SYBR Green Ⅰ都可以用于RQ-PCR,但是Eva Green更敏感高效;监测融合基因表达可以有效观察不同治疗方法的治疗效果.     

实时荧光定量PCR检测PML-RARα融合基因的临床应用研究

目的 利用PML-RARα融合基因作为标志物,应用实时荧光定量PCR技术,监测急性早幼粒细胞白血病(APL)微小残留病(minimal residual disease,MRD)患者体内病毒的状态,探讨预测APL复发风险的方法.方法 利用本实验室建立的定量检测APL患者PML-RARα融合基因的方法,对25例处于初诊、完全缓解(complete remission,CR)、复发等不同阶段的APL患者进行了PML-RARα融合基因的定量检测,并对其中6例患者的MRD状态进行了动态监测.结果 应用荧光定量PCR技术分析患者初诊、CR和复发状态的PML-RARα基因对数值(lg)水平,结果 显示有统计学意义(x2=6.847,P＜0.05);随访期患者的PML-RARα对数值(lg)水平变化较大:初诊时较高(-0.61±0.79),CR时下降(-1.31±0.62),复发时又出现上升(-0.57±0.44),提示若该患者在CR时的对数值呈现上升趋势,患者复发的机率大.结论 应用实时荧光定量(RQ)-PCR技术定量检测PML-RARα融合基因,对监测APL患者MRD状态具有临床适用性,随访期的MRD动态追踪监测具有预后价值.     

巢式RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因的意义

目的 探讨巢式RT-PCR技术在检测急性早幼粒细胞白血病(APL)患者PML/RARα融合基因的价值。 方法 采用巢式RT-PCR检测218例初诊为APL患者的PML/RARα融合基因的表达水平及在部分患者的动态变化;随机选择39例APL完全缓解(CR)的患者,分别用流式细胞术(FCM)和巢式RT-PCR监测外周血或骨髓中的微小残留病(MRD)白血病细胞。 结果 在确诊的167例APL患者中PML/RARα融合基因阳性率为90.4%(151/167);39例APL-CR患者中PML/RARα融合基因阳性率76.9%(30/39);FCM和巢式RT-PCR监测APL-CR患者MRD有很好的一致性(P＞0.05)。 结论 巢式RT-PCR对APL的诊断有高灵敏度和高特异性;对APL的疗效及预后判断有重要临床意义。     

筑巢式RT-PCR检测早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因

目的检铡急性早幼粒细胞白血病(APL)中染色体易位t(15；17)所形成的早幼粒细胞白血病-维甲酸受体α(PML-RARα)融合基因转录本。方法筑巢式逆转录酶／多聚酶链反应(RT-PCR)。结果在30例APL中，L型18例，S型10例，另有两例完全缓解者(CR4年和6年)未检测到上述转录本。10例初治APL同时进行PML-RARα融合基因和细胞遗传学检查，10例患者均植铡刊PML-RARα融合基因，而只有6例检测到t(15；17)易位染色体。结论PML-RARα融合基因植铡在APL的诊断、疗效评价及MRD的监测中是一个快速、准确且灵敏的方法。     

维甲酸和砷剂联合诱导急性早幼粒细胞白血病中PML-RARα表达上调不影响预后(英文)

急性早幼粒细胞白血病(APL)接受维甲酸和砷剂诱导治疗早期的分子动力学及其临床意义尚不清楚。本研究对32例初治APL进行动态检测,利用实时定量PCR和间期荧光原位杂交(FISH)方法检测PML-RARα转录本水平(PML-RARα/ABL)和细胞遗传学。结果表明,诱导14 d时PML-RARα转录本水平比治疗前显著升高(40.10%和57.74%,P<0.01),诱导28 d和巩固治疗结束时PML-RARα转录本分别为:6.97%和0%。在诱导治疗14 d和28 d分别有65.62%和31.25%患者发生PML-RARα转录本增加。治疗前、诱导14 d和诱导28 d PML-RARα拷贝数/每个APL细胞为0.9,2.2,1.4(PML-RARα/ABL×2/APL细胞%)。中位随访时间为22个月,32例患者均无复发。结论:PML-RARα表达上调是急性早幼粒细胞白血病接受维甲酸和砷剂联合诱导治疗过程中一个普遍现象,对疾病预后无影响。     

免疫荧光动态监测急性早幼粒细胞白血病患者PML-RARα融合蛋白变化

背景：实时定量RT-PCR只能间接地反映融合基因表达量的变化,并不能在细胞原位直观反映急性早幼粒细胞白血病患者细胞内PML-RARα融合蛋白在全反式维甲酸治疗前后的相对表达量。目的：探讨免疫荧光技术检测融合蛋白PML-RARα表达的动态变化在判断急性早幼粒细胞白血病的全反式维甲酸早期治疗的效果。方法：应用免疫荧光技术检测全反式维甲酸干预的急性早幼粒细胞白血病经典细胞株NB4细胞或来源于急性早幼粒细胞白血病患者的NB4细胞PML-RARα蛋白的表达,以实时定量RT-PCR检测细胞PML-RARα mRNA的表达作为对照,以评价免疫荧光技术的可靠性。结果与结论：免疫荧光染色显示,无论是体外培养的NB4细胞,还是患者骨髓内的NB4细胞,在全反式维甲酸干预前细胞内均可见大量红色的融合蛋白PML-RARα,大小不均一、形状不规则,全反式维甲酸干预后,NB4细胞内红色的融合蛋白PML-RARα形状逐渐规则,弥散状态变为散在分布,且随着全反式维甲酸干预时间的延长,原有的弥散状态逐渐消失。实时定量RT-PCR测得的PML-RARα mRNA的变化趋势与免疫荧光相一致。说明免疫荧光技术检测PML-RARα能够更为直观地判断全反式维甲酸的治疗效果。     

PML-RARα对BHLHB2基因转录调控的影响

本研究探讨异常转录因子PML-RARα对BHLHB2基因的转录调控机制,进一步揭示急性早幼粒细胞性白血病(APL)的致病机理。利用RT-PCR技术研究PML-RARα融合蛋白及ATRA在APL模式细胞株PR9和APL病人来源的NB4细胞中对BHLHB2转录的影响;利用ChIP-PCR技术探讨PML-RARα在体内调控BHLHB2转录的作用方式;通过分析病人样本数据,观察BHLHB2在各种急性髓系白血病(AML)中的表达情况。结果表明,随着PML-RARα融合蛋白的表达升高,BHLHB2的转录受到明显抑制,并且无论在APL模式细胞株PR9还是APL病人来源的NB4细胞中,ATRA均能够解除这种抑制,诱导BHLHB2的表达上调;而在不表达PML-RARα的U937细胞株中,ATRA不能诱导BHLHB2的表达上调。研究结果提示,PML-RARα通过结合于BHLHB2的启动子区域抑制其转录。与其他类型的AML和正常的骨髓细胞相比,BHLHB2在APL中表达较低。结论:BHLHB2是PML-RARα的靶基因,PML-RARα通过与其启动子区域结合对其转录进行负调控。     

急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因实时定量RT-PCR标化法和常规法计算的比较

目的 改进实时定量RT-PCR的检测计算方法,提高定量RT-PCR在急性早幼粒细胞白血病(APL)微量残留病变监测的临床应用价值.方法 采用实时定量RT-PCR和常规定性RT-PCR检测31例APL患者在治疗前后融合基因PML-RARα的表达水平,对两种计算方法进行比较:常规按照患者治疗前后自身比较计算(常规法)和治疗前标准化基线水平计算(标化法).结果31例患者采用两种定量计算方法结果近似,标化法计算结果示患者在治疗缓解、巩固治疗和维持治疗期间融合基因PML-RARα转录本对数下降值分别为(2.0±1.9)、(4.9±1.4)和(5.7±0.1),常规法计算结果为(1.9±1.9)、(4.8±1.3)和(5.7±0.4).在维持治疗阶段标化法定量RT-PCR的结果显示患者个体差异更小.按照标化法计算结果,次要分子生物反应(对数值≥3)和主要分子生物反应(对数值≥5)标准仍然适用.结论 采用标化法计算实时定量RT-PCR结果能较好的对APL患者的微量残留病变进行监测,一定程度上降低了患者个体差异对检测结果的影响,同时适用于治疗前标本缺如的患者.     

Targeting expression of the leukemogenic PML-RARα fusion protein by lentiviral vector-mediated small interfering RNA results in leukemic cell differentiation and apoptosis

Acute promyelocytic leukemia (APL) results from a chromosomal translocation that gives rise to the leukemogenic fusion protein PML-RARα (promyelocytic leukemia-retinoic acid α receptor). Differentiation of leukemic cells and complete remission of APL are achieved by treatment of patients with pharmacological doses of all-trans retinoic acid (ATRA), making APL a model disease for differentiation therapy. However, because patients are resistant to further treatment with ATRA on relapse, it is necessary to develop alternative treatment strategies to specifically target APL. We therefore sought to develop a treatment strategy based on lentiviral vector-mediated delivery of small interfering RNA (siRNA) that specifically targets the breakpoint region of PML-RARα. Unlike treatment with ATRA, which resulted in differentiation of leukemic NB4 cells, delivery of siRNA targeting PML-RARα into NB4 cells resulted in both differentiation and apoptosis, consistent with the specific knockdown of PML-RARα. Intraperitoneal injection of NB4 cells transduced with lentiviral vectors delivering PML-RARα-specific siRNA but not control siRNA prevented development of disease in nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mice. Taken together, these results indicate that development of PML-RARα-specific siRNA may represent a promising treatment strategy for ATRA-resistant APL.     

PML-RARα及p21是维持急性早幼粒细胞白血病干/祖细胞生存的关键因素

肿瘤干/祖细胞是肿瘤组织内具有自我更新、分化成为肿瘤组织内所有细胞群体及持续增殖能力的起始细胞,被认为是肿瘤复发、耐药以及转移的根源.急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)作为急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)的一个亚型,因全反式维甲酸和砷剂治疗对其具有良好效果而成为肿瘤靶向治疗的典范.本文通过总结近期关于APL干/祖细胞的研究,说明APL内可能存在着两群APL干/祖细胞,而APL干/祖细胞可能依赖于致癌PML-RARα融合蛋白、细胞周期抑制物p21、自我更新相关的分子以及趋化因子等维持其自我更新及生存,而全反式维甲酸及砷剂主要是通过降解PML-RARα融合蛋白、激活FOXO3A、抑制自我更新相关信号通路Shh的活化而达到清除APL于/祖细胞的效应,这对于指导其他肿瘤的治疗有重要意义.     

实时定量聚合酶链反应动态监测白血病治疗后微小残留病研究

目的建立急性早幼粒细胞白血病(APL)实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)检测方法,并检测APL治疗后微小残留病(MRD),评价MRD检测的意义。方法应用RQ-PCR对96例APL患者的骨髓标本进行分析,检测PML/RARa融合基因的转录水平。结果 (1)RQ-PCR与传统巢式PCR(RT-PCR)检测结果的差异有统计学意义(P<0.05),提示应用RQ-PCR检测PML/RARa融合基因转录水平的敏感性高于RT-PCR。(2)RQ-PCR可对PML/RARa融合基因进行定量检测,监测患者的PML-RARa融合基因拷贝数水平变化,结果显示初诊时较高,有效治疗后迅速下降,复发时又出现上升,提示若患者在完全缓解(CR)后PML/RARa融合基因拷贝数呈现上升趋势,其复发机率大。结论 RQ-PCR检测作为APL治疗后微小残留病检测的方法,准确可靠,可以判断治疗效果,预测疾病复发,早期给予干预治疗,有重要的临床应用价值。