膜芯片技术对牛、羊、牦牛、驴肉源食品的掺伪鉴别

采用膜芯片技术,通过对牛、羊、驴、牦牛、鸡、鸭、兔、貂、狐、鼠、猪11 种目标物种的检测,实现对牛、羊、驴、牦牛物种的掺伪鉴别。结果表明：该方法具有良好的特异性和适用性,检测灵敏度和掺伪灵敏度均可达到0.1%,能快速、准确地同时鉴别牛、羊、驴、牦牛、鸡、鸭、兔、貂、狐、鼠、猪11 种动物源性成分,可满足肉类食品样品中对牛、羊、牦牛、驴等掺伪鉴别的检验需求。     

北京地区牛、羊肉片中鸭、鸡、猪源性成分调查

建立生肉制品中鸭、鸡、猪源性成分的荧光PCR检测方法,对北京地区出售的牛、羊肉片进行成分调查。方法 合成检测鸭、鸡、猪源性成分的特异性引物和探针,建立实时荧光PCR检测方法,测定方法的特异性、灵敏度,在北京部分超市、农贸市场、餐馆采集牛、羊肉片进行成分调查。结果 所建立的实时荧光PCR方法对鸭、鸡、猪源性成分具有较好特异性,与常见食用肉类DNA在Ct 30以内无交叉反应;对混合肉中鸭、鸡、猪成分DNA的检出限是0.1%。北京市场上采集的86份牛、羊肉片中,30份检出上述成分,占34.9%;羊肉片的掺假率高于牛肉片;农贸市场采集样品掺假率明显高于超市和餐馆。结论 所建生肉制品中鸭、鸡、猪源性成分的检测方法简单、特异,对样品的检测结果显示,北京市售牛、羊肉中存在掺入鸭、鸡、猪肉的现象。     

基于分子信标技术的肉类食品动物源性成分多重筛检方法

建立一种基于通用型分子信标检测及探针熔解曲线分析技术的肉类食品动物源性成分多重筛检方法。通过对猪、牛、羊等9种常见食用畜禽动物基因组多序列比对及生物信息学分析,选取线粒体基因组16s r DNA中具有特定结构的基因片段作为检测靶序列,设计单一的通用型引物和长链分子信标。以标准基因重组载体及实体样品基因组为检测对象,确定各动物源性成分特征退火温度(Tm),建立基于实时荧光PCR及熔解曲线分析的标准检测方法,并对筛检方法的灵敏度和特异性进行考察。应用所建立检测方法,9种畜禽动物基因组扩增产物单一,测序结果与参考序列一致。对梯度稀释的猪标准基因重组载体检测发现,终浓度10⁸～10¹copies/μL模板扩增Ct值范围为15～36个循环(回归系数R²=0.99),熔解峰特征Tm为(68.0±0.1)℃。对9类畜禽肉类标准基因重组载体和实体样品进行独立检测,各类动物源性基因均形成可辨识的特异性熔解峰(Tm分别为猪68.0℃、牛64.3℃、羊65.1℃、驴65.8℃、马63.4℃、驼60.6℃、狗61.8℃、鸡52.6℃、鸭56.7...     

加工食品中若干动物成分的PCR检测技术应用研究

本研究应用PCR技术检测了12种加工食品中的牛、羊、鸡、猪等动物源性成分，在此基础上还开发了真核生物所共有的18S核糖体DNA（18S rDNA）与食品中牛、羊、鸡、猪等多种动物物种特异性基因片段之间的二重PCR检测方法，还分析了牛、羊源性成分单PCR检测的灵敏度，以及18S rDNA与牛、羊之间的二重PCR检测方法的灵敏度。     

基于DNA测序方法检测生鲜肉中5种动物源性成分

目的建立生鲜肉中猪、牛、羊、鸡、鸭源性成分的DNA测序鉴别方法,并对采集自北京各地区生鲜肉品进行检测验证。方法合成动物线粒体上12S rRNA、cytochrome b、cytochrome c oxidase基因引物,建立猪、牛、羊、鸡、鸭源性成分的DNA测序鉴别方法,并对50份猪、牛、羊、鸡、鸭肉品进行检测。结果使用线粒体上12S rRNA、cytochrome b、cytochrome c oxidase基因引物对猪、牛、羊、鸡、鸭肉品进行扩增,分别获得456、400和710 bp大小的DNA片段。只有12S rRNA基因引物均可对此5种动物源性成分扩增且效果良好。扩增产物进行序列测定。根据序列构建的系统进化树发现,此方法可有效区分样品中猪、牛、羊、鸡、鸭源性成分。结论此方法快速、简便,可准确检测50种生鲜肉样品中的动物源性成分,作为肉类鉴别的新方法。     

肉制品中狗、狐、貂源性成分DNA检测试剂盒的制备

为快速检测肉制品中狗、狐、貂3 种常见犬型总科动物源性DNA成分,应用分子生物学技术分析种属基因组序列差异,建立并优化多重聚合酶链式反应检测体系,开发快速检测试剂盒。结果表明：快速检测试剂盒特异性良好,与常见肉类动物（猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭）源性DNA成分皆无交叉反应;灵敏度高,3 种靶标样品DNA质量浓度同时降至10－4 ng/μL,仍可准确检测;阳性条带经切胶回收、克隆转化、测序比对,与GenBank已登记的狗（MH105046.1）、狐（LT560065.1）、貂物种（KU145464.1）相似性为100%;对30 份模拟混合肉样进行鉴别检测,检测结果与预设混合情况完全相符;50 份市售样品中,狗肉样品中3 份出现掺假现象。     

普通聚合酶链式反应鉴定牛肉及其制品中的牛源性成分

依据牛种属的线粒体细胞色素b(cytochrome b,Cytb)基因上的保守序列设计牛源特异性引物对,建立一种特异性强、灵敏性高、耗时短的鉴定食品中牛源性成分的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。选取牦牛、水牛、黄牛品种及羊、猪、鸡、鸭、鹅、兔、马、驴、鱼、大豆、玉米等动植物源成分进行特异性试验。结果显示:所建立的方法高度特异于牛源性检测,其他非牛动植物源成分均无扩增条带。采用常见的牛品种进行灵敏性试验,结果显示所建立的方法可检测到的最低牛DNA量为0. 2 pg;将牛肉分别与猪肉、驴肉、羊肉、大豆组织混合进行PCR测定,结果表明最低检测限为鲜样品含0. 01%质量分数的牛源成分,高压121℃、0. 1MPa,20 min处理样品含0. 01%质量分数的牛源成分。对市售食品中牛源性成分检测结果与现行PCR牛源性成分检测标准方法的检测结果 100%一致。     

双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术结合核酸杂交侧流条快速检测牛肉中的鸡、鸭、猪源性成分

目的? 建立快速、简便、经济的双拖尾重组聚合酶恒温扩增结合核酸杂交试纸条快速检测牛肉中鸡源、鸭源、猪源性成分的可视化检测技术。方法? 采用多重双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术(multiplex recombinase polymerase amplification,mRPA)与核酸杂交试纸条相结合。对鸡、鸭、猪线粒体D环区域设计特异性拖尾RPA引物,扩增出双拖尾的RPA产物。鸡、鸭、猪3个物种RPA产物的拖尾序列分别与红、黄、蓝三种颜色的金纳米探针和试纸条上的检测探针杂交,形成肉眼可见的红、黄、蓝三色条带,整个RPA扩增(15 min)和试纸条检测(5 min)过程在20 min内即可完成。结果? 该方法对牛肉中鸡、鸭、猪肉的检测限达0.01%,且仅对鸡、鸭、猪肉DNA有特异性,与其他10个物种的DNA均无交叉反应。采集50份市售牛肉样品,使用该方法进行真实性检测:10份牛肉干、10份生牛肉、10份酱牛肉中未检测出其他动物源性成分,10份牛肉馅料中检测出1份含猪源性成分,10份牛肉片中检测出1份含鸡源性成分。该方法与PCR结合凝胶电泳的检测结果具有很好的一致性。结论? 双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术结合核酸杂交试纸条具有特异性强、灵敏度高,操作简单的优点,可实现牛肉中鸡、鸭、猪源性成分的同时可视化快速检测。     

PCR法快速检测熟肉制品中肉类来源

应用分子生物学技术进行熟肉制品种类来源的快速检测是目前市场监控方面的空白.通过查阅国内外的相关文献,同时进行基因序列的比对,确定针时市场上常见肉类猪、牛、羊、鸡的特异性线粒体序列的引物.经过多次重复试验证明,所选定的引物只有在同一种属模板DNA存在的情况下才会发生PCR扩增,特异性强,灵敏度高.建立的方法仅需20 mg的样品,而样品中含有1 mg的待检肉类就可以被检出.     

同时检测速冻食品中鸡、鸭、猪和牛源性成分实时荧光聚合酶链式反应方法的建立及应用

以鸡转化生长因子β-3(transforming growth factor beta-3,TGFB3)基因、猪朊蛋白(prion protein,PRNP)基因和鸭、牛生长激素(growth hormone,GH)基因为靶基因,设计合成特异性引物和TaqMan探针,通过对实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)体系和反应条件的优化,建立同时检测速冻食品中鸡、鸭、猪和牛源性成分的实时荧光PCR检测方法。结果表明:本研究所建立的方法只在鸡、鸭、猪或牛源性成分存在时才产生特异性扩增曲线,表明该方法具有良好的特异性;且对鸡、鸭、猪和牛源性成分的最低检测质量浓度分别可达到10.0、1.0、10.0、10.0 pg/μL,具有良好的灵敏性;应用建立的检测方法对市售34份速冻食品鸡、鸭、猪和牛源性成分进行同时检测,能够实现对速冻食品中4种动物源性成分的有效检测,进一步分析发现,15份速冻食品源性成分测定结果与外包装标注成分不一致。本研究所建立的同时检测速冻食品中鸡、鸭、猪和牛源性成分的实时荧光PCR检测方法具有良好的特异性和灵敏性,且操作简单、适用范围广,能够满足日常检测需求。     

Identification of chicken,duck, pigeon and pig meat by species-specific markers of mitochondrial origin

In the present study, PCR based method for meat species identification of chicken, duck, pigeon and pig was achieved by developing species-specific markers. Using mitochondrial sequences species-specific primers were designed and the sizes of them were 256 bp, 292 bp, 401 bp and 835 bp for chicken, duck, pigeon and pig, respectively. The species-specific PCR products were sequenced to confirm the specificity of the product amplified. These markers were subsequently tested for cross amplification by checking them with beef, mutton, chevon, pork, rabbit, chicken, duck, turkey and pigeon meat. DNA markers developed in this study can help identify the species of fresh, cooked and autoclaved meat of chicken, duck and pigeon and fresh and cooked meat of pig. The process of identification is simple, economical and quick as compared to other methods such as RAPD, PCR-RFLP and sequencing method of species identification.     

加工食品中动物源DNA的提取和多重PCR检测方法的建立

为了从深加工食品中提取高质量和数量的动物源性DNA片段,以优化后CTAB方法提取,用于PCR检测。根据鸭线粒体基因序列,设计合成检测鸭源性成分引物,进行PCR体系和反应条件的优化筛选,建立三重PCR方法;同时扩增出牛源性116bp、猪源性212bp和鸭源性322bp目的基因片段。建立的三重PCR方法特异地鉴定牛肉及其制品中掺假猪和鸭源性成分,对打击食品掺假伪造、审核食品标签、保障消费者知情权、维护消费者健康等方面有重要作用。     

PCR方法快速鉴别食品中肉的种类

本文针对食品中肉成分种类鉴别开发了一种快速灵敏的PCR检测方法,可检测食品中是否存在猪肉、牛肉、羊肉以及鸡肉等成分。采用微波助提法提取样品中DNA,简化了前处理步骤,可在短时间内完成从多种不同类型肉与肉制品中提取肉成分DNA。为了评价方法的可靠性与灵敏度,猪肉以及掺入了不同比例浓度猪肉成分的食品样品采用本方法进行了核酸提取与PCR分析。检测结果表明,方法可检测出低至含有0.5%浓度的猪肉成分的混合样品。随机抽取50份不同类型的市面食品样品,检测出5份食品含有猪肉成分,7份食品中含有牛肉成分,5份食品中含有羊肉成分。该样品前处理方法、DNA提取方法以及PCR检测方法可广泛应用于食品中肉成分种类的检测鉴别。     

2013年苏州地区肉及其制品掺假情况调查

了解苏州地区肉及其制品的掺假情况,通过对肉类种源与标签明示肉源进行比对,鉴别摻假食品,为加强食品标签管理提供依据。方法 运用自建的动物源性食品种源判定Taqman实时荧光PCR检测体系对苏州地区的肉及其制品进行种源判定,与标签明示肉源进行比对,鉴别摻假食品。结果 本次调查共检验涉及32个生产单位的90份样品,总不符合率为25.6%(23/90)。检测的44份牛肉及其制品中有12份与标签不符,8份用猪肉部分替代牛肉,1份以鸭肉部分代替牛肉进行销售;此外有3份不含有牛肉成分,存在猪、鸡、鸭源性肉类之外的肉类成分。共检测羊肉及其制品16份,有2份用鸭肉代替羊肉出售,3份羊肉样品中掺入了部分猪成分,其中1份样品还存在单个样品掺杂两种外源肉类的现象(猪源性和鸭源性)。检测猪肉及其制品19份,其中2份样品含有标签未注明的鸡肉成分。在所检测的11份混合肉类样品中有4份成分与标签不符,主要是以廉价的鸡肉取代/部分取代相对高价的牛肉和猪肉。结论 肉制品掺假情况明显,用猪肉、鸭肉部分代替牛肉和羊肉仍是主要的掺假手段,牛肉掺假样品主要是熟制牛肉制品,而火锅食用羊肉卷样品则是羊肉掺假高危品,开展肉制品摻假检测对规范肉制品市场具有积极意义。此外,3份未知种源成分的牛肉样品提示在现有检测基础上还需扩大检测范围,防患于未然。     

非标记蛋白定量方法在掺假肉鉴别中的应用

目的建立一种非标记蛋白定量法鉴别牛肉或羊肉中是否掺假。方法采用四极杆串联飞行时间高分辨质谱分析各种肉类蛋白酶解之后的样品,找到每种肉类特异的肽段,再用串联四极杆质谱测定特异肽段的定量结果,判定样本中是否有这种肉类存在。结果在测定的牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉和鸭肉样本中,均找到每种肉类的特异肽段5～7条,从每种肉中选择3条肽段进行定量分析,可以很好地鉴别出牛羊肉中掺杂的其他肉类。结论该方法操作简便,结果可靠,灵敏度高,可用于在牛肉或羊肉中掺杂其他肉类的鉴别。     

DNA条形码COI序列在常见肉类鉴别中的应用研究

为了对常见的4种肉类及相关肉制品进行掺假鉴定,判别与产品标签是否相符,本研究以COI基因为靶基因,建立了4种动物源性食品DNA条形码鉴别技术。分别提取牛、羊、猪、鸭四大物种的基因组DNA为模板,以其COI基因的保守序列区设计6对通用引物,结合文献报道及数据库提供的7对通用引物进行PCR扩增,并将测序结果提交Gen Bank数据库Blast比对,评价不同DNA条形码的检测鉴别能力。筛选出COI-A为最优序列,在4个物种中扩增效率100%。对抽检的20个批次的肉加工品样品进行检测,鉴定结果约有90%的样品与产品标签标示的成分相符。其中1个批次的牛丸制品因肉类成分含量低未扩增成功,1个批次的牛丸制品检出鸭源成分,判定掺假。DNA条形码技术快速有效,本研究筛选的COI-A序列可直接用于牛、羊、猪、鸭及其肉制品的鉴定,并为其它常见动物源性食品的种类鉴定提供一定参考依据。     

Ready-to-use single tube quadruplex PCR for differential identification of mutton,chicken, pork and beef in processed meat samples

ABSTRACT

A reliable and sensitive identification method is required to tackle food adulteration mainly in meat production. We developed a dry reagent based ready-to-use single tube quadruplex PCR assay for accurate identification of chicken, mutton, beef and pork. The assay was found to be specific and reproducible. Thermo-stability studies of lyophilized PCR master mix were conducted at different temperature and time intervals, which revealed significant stability for 75 days at 4°C and for 60 days at 25°C. The developed assay was shown to be sensitive down to 16 pg DNA per reaction and the detection limit was found to be 0.01% (w/w) of each species. Furthermore, this method has been applied to the analysis of 68 commercial meat products and the results indicated that nine samples contained non-declared meat components. This dry reagent-based quadruplex PCR assay can be utilized to monitor various processed food products and also to maintain quality control in food industries mainly in the resource-limited settings.     

基于COI序列的DNA微条形码技术鉴别熟肉制品中11种肉掺假的研究

建立并优化了基于COI序列的DNA微条形码技术（mini-barcoding）检测熟肉制品中11种常见肉类掺假的方法。样品经超声与真空冷冻干燥处理,提取DNA模板和PCR扩增后,目标扩增物经切胶纯化后进行克隆测序,并将测序结果提交GenBank数据库Blast比对。筛选出适合猪、牛、羊、鸡、鸭、鸽子、马、驴、鹅、兔、鼠11种肉类的扩增的通用引物COI-A,对PCR扩增条件进行优化,并建立18个掺假模式,对低经济价值肉类（猪、鸡、鸭、马、驴、鼠）的掺入的最低比例进行考察。结果表明:11种熟肉的DNA经通用引物COI-A扩增后,其扩增效率均为100%,18个掺假模式中,牛肉和羊肉中掺入6种低经济价值肉类的最低检出比例为5%,而掺入鸡肉的最低检出比例为10%,而鹅肉、鸽子肉和兔肉的掺假模式中最低检出比例为10%;利用本方法检测30批次市售样品,发现有18批次的熟肉制品存在掺假情况。该方法前处理简单,灵敏度合适,重现性好,可作为高经济价值熟肉制品中掺假低经济价值肉类的有效检测方法。     

HDA法用于检测肉中金黄色葡萄球菌的研究

本文研究了猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌的依赖解旋酶恒温基因扩增检测方法mDA法）,以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶ruc粥基因为目的基因,设计一对特异性引物,优化反应条件uvrDhelicase、T4gp32的浓度,通过赖解旋酶恒温基因扩增方法直接检测猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌,扩增产物通过电泳进行检测。结果表明,HDA法检测肉中金黄色葡萄球菌的特异性强,试验涉及的其它菌株未发生扩增,只有金黄色葡萄球菌得到与设计序列长度一致的216bp基因片段,检出限为10^5CFU／g,优化确定UvrDhelicase、T4gp32的终浓度分别为0．1gg、5．0gg,该方法用于检测猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌的灵敏度高,耗时短,为猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌的快速检测提供了新的方法,也为其它食品中金黄色葡萄球菌的快速检测奠定了基础。