人β防御素2（HBD2）与人乳头瘤病毒HPVl6E6羧基端编码基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的构建人β防御素与人乳头瘤病毒HPV16E6羧基端基因的真核表达质粒，并检测其在真核细胞中的表达情况，探讨其作为DNA疫苗治疗宫颈癌的可行性。方法利用分子克隆技术，将HBD2基因片段与HPV16E6羧基端基因片段连接，插入真核表达质粒pcDNA3．1，经测序鉴定后，用阳离子脂质体法转染真核细胞COS7，RT—PCR及免疫组化法检测其表达。结果重组质粒pcDNA3．1／HBD2～HPV16E6C转染COS7细胞48小时后，RT—PCR扩增出插入的HBD2--HPV16E6C片段，免疫组化染色呈棕黄色阳性反应。结论人β防御素与人乳头瘤病毒HPV16E6羧基端融合基因能在真核细胞中有效表达，为今后进行整体动物DNA免疫试验奠定了基础。     

Immune response to plasmid DNA encoding HPV16-L1 protein

Objective To test the immunogenicity of recombinant plasmid DNA containing human papillomavirus type 16-L1 (HPV16-L1) coding sequence of mice.Methods The HPV16-L1 encoding sequence was generated by polymerase chain reaction (PCR), and inserted into TA cloning vector PCR Ⅱ, then cloned in the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 with CMV promoter. The recombinant plasmid DNA pcDNA-L1 was transferred into Cos-7 cells and used to immunize BALB/c mice via muscular injection. The expression of HPV16-L1 in transferred cells was identified by immunospot and immunocytochemistry, which tested specific anti-HPV16-L1 antibody in the serum of immunized mice. Results Using the immunospot technique, we found L1 protein expression in pcDNA-L1 transferred cells. The immunocytochemistry studies demonstrated that the L1 protein was located in nuclei. In immunized mice, specific anti-HPV16-L1 antibodies could be detected by immunospot and immunocytochemistry 28 days after the first immunization and last at least 41 days. Conclusions We constructed HPV16-L1 eukaryotic expressing plasmid whose DNA could induce immuno-humoral response in mice. This observation will be helpful in designing HPV16 prophylactic vaccine.     

肺炎链球菌CbpA基因疫苗的构建及免疫学特性

目的：构建含有肺炎链球菌（SPN）毒力因子CbpA抗原编码基因的重组质粒pcDNA3.1/CbpA,测定其诱导特异性免疫应答的能力并评价其保护效果.方法：PCR扩增SPN CbpA编码基因,将该编码基因克隆到pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,构建pcDNA3.1/CbpA重组质粒,经测序鉴定后转染COS-7细胞,WesternBlot鉴定目的蛋白的表达,重组质粒免疫BALB/c小鼠,TIGR4型SPN攻击后,监测其生存时间.结果：CbpA能在COS-7细胞中表达;pcDNA3.1/CbpA重组质粒主动免疫BALB/C小鼠后,体内产生特异性IgG抗体,并诱导小鼠对SPN感染产生有效的保护.结论：成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1/CbpA,可为SPN基因疫苗的研制提供依据.     

汉坦病毒包膜糖蛋白基因核酸免疫的初步研究

目的将克隆有汉坦病毒包膜糖蛋白基因M片段及G1、G2基因的重组质粒免疫动物，了解上述目的基因在核酸疫苗中的应用价值。方法大量制备已构建好的pcDNA3．1-M、pcDNA3．1-G1、pcDNA3．1-G2重组质粒DNA及对照空质粒pcDNA3．1。然后用这四组质粒DNA通过肌肉注射的方法免疫6～8周龄的BALB／c小鼠（每组5只），每4周免疫一次，共免疫3次，每次免疫前及最后一次免疫后2周断尾取血，用免疫荧光的方法检测基因免疫的体液免疫应答效果。结果重组质粒pcDNA3．1-G1免疫小鼠有4只血清抗汉坦病毒抗体为阳性，重组质粒pcDNA3．1-G2以及重组质粒pcDNA3．1-M免疫小鼠各有1只血清抗汉坦病毒抗体为阳性。结论汉坦病毒糖蛋白基因核酸免疫动物后可刺激机体产生特异性的体液免疫应答。     

嗜肺军团菌pilE基因体外表达及其免疫原性研究

目的 构建嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛pilE基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-pilE,研究其真核细胞中的表达及其免疫原性.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌pilE基因,将其定向插入载体pcDNA3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1.-pilE.经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-pilE转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western-blot分别鉴定pcDNA3.1-pilE的瞬时和稳定表达产物.将pcDNA3.1-pilE作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN-γ产生水平、CTL杀伤活性等指标,评价疫苗的免疫原性.结果 扩增出了429 bp的PilE基因,在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,在相对分子质量15000处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-pilE在细胞内表达PilE蛋白.pcDNA3.1-pilE免疫组的免疫原性均高于对照组pcDNA3.1( )组(P＜0.01).结论 成功构建了嗜肺军团菌pilE基因的真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中得到了表达,免疫小鼠后诱导了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答.     

霍乱肠毒素基因DNA疫苗的构建和体外表达

目的构建霍乱弧菌ctxAB融合基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法用限制性核酸内切酶从原核表达重组质粒pET32a-ctxAB上切下ctxAB基因,导入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-ctxAB。用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ctxAB转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot对pcDNA3.1-ctxAB的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定。结果真核表达重组质粒pcDNA3.1-ctxAB成功转入NIH3T3细胞,利用免疫荧光技术检测到其在细胞膜和细胞浆中获得瞬时表达,对稳定转染细胞用Western blot分析,发现在约40.5kDa处有阳性杂交信号。结论成功构建霍乱弧菌ctxAB基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中获得表达。     

融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7的构建及其免疫学特性研究

目的 构建融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7,并评价其体外实验和动物模型上的免疫学特性,尤其是抗病毒致病基因的特异性细胞免疫反应.方法 分别构建DNA重组体pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7,pcDNA3.1-CRT180,pcDNA3.1-HPV6E7.将pcDNA3.1-HPV6E7质粒经脂质体介导转染B16细胞,以G418筛选阳性细胞集落,荧光显微镜观察和RT-PCR鉴定表达HPV6E7的阳性细胞株.将质粒DNA肌注免疫C57BL/6小鼠,3次后取全血经流式细胞仪检测T细胞亚群的变化,LDH法检测小鼠的脾细胞和淋巴细胞与靶细胞B16/HPV6E7孵育后的CTL活性以及ELISA法检测共孵育上清中IL-2和IFN-γ浓度的变化.结果 各组质粒经鉴定表明构建正确.转染后细胞株稳定表达HPV6E7.DNA疫苗免疫小鼠后,pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7免疫组较pcDNA3.1-HPV6E7免疫组的外周血CD8 T细胞和TCRγδT细胞的比例显著增加,脾细胞和淋巴细胞针对靶细胞B16/HPV6E7的CTL杀伤活性更明显,分泌IL-2和IFN-γ的水平升高(P＜0.05).结论 CRT180与HPV致病基因6E7相连的重组质粒疫苗pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7能引发小鼠T细胞亚群CD8 分化并诱导出显著的特异性CTL反应.推测CRT180/HPV6E7 DNA疫苗在动物模型上可以有效激活抗HPV特异性细胞免疫,有利于病毒感染的清除.     

猪endoglin胞外段真核表达载体的构建及其诱导抗小鼠自身endoglin抗体的实验研究

目的分别扩增猪和小鼠endoglin胞外段cDNA,构建真核表达载体作为DNA疫苗,了解猪endoglin DNA疫苗是否能够在小鼠体内诱导产生抗小鼠endoglin的自身抗体.方法利用RT-PCR技术,从猪和小鼠胚肝中分别扩增出猪和小鼠的endoglin胞外段,用内切酶消化后分别将其插入真核表达质粒pcDNA3.1( )中,经琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定后,体外转染真核细胞COS-1,用RT-PCR和免疫印迹鉴定是否能正确表达.然后大量扩增和提取相应质粒,将这些质粒作为DNA疫苗,肌注免疫小鼠,通过ELISA、免疫印迹和ELISPOT测定抗自身endoglin的抗体和脾脏中分泌特异性抗endoglin抗体的B淋巴细胞.结果琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定证实RT-PCR扩增的cDNA及构建的重组真核表达质粒正确,重组的真核表达质粒能在COS-1细胞中正确表达,猪endoglin胞外段真核质粒DNA疫苗免疫小鼠可以诱导产生抗小鼠endoglin的自身抗体.结论重组猪endoglin胞外段真核表达载体可作为DNA疫苗用于抗肿瘤血管生成的基因治疗.     

EB病毒LMP2-LMP1Δ融合基因免疫效果的初步研究

目的构建EBV LMP2-LMP1Δ融合基因,初步观察融合基因体内诱导EBV特异性细胞免疫应答的效果。方法 （1）应用PCR方法构建包含EBV-LMP2全长和去除致癌基因的EBV-LMP1Δ融合基因,并将融合基因插入到pcDNA3.1（＋）-his真核表达载体中,构建重组表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ,Western blot和免疫荧光方法检测融合蛋白的表达。（2）使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ及携带LMP1Δ和LMP2基因的重组腺病毒单独或联合免疫Balb/c小鼠,末次免疫1周后应用IFN-γELISPOT方法检测小鼠脾淋巴细胞中EBV特异性CTL水平。结果 （1）真核表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ能够在293细胞中表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,融合蛋白分子量大小正确,具有免疫原性。（2）重组质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ免疫小鼠能够诱导出EBV特异性的CTL,但诱导的CTL水平很低,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数只有12个,远远低于LMP1Δ、LMP2重组腺病毒平均495个斑点数的免疫结果。但使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ和重组腺病毒联合免疫,与只使用重组腺病毒相比,诱导的EBV特异性CTL水平能够显著提高,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数可达1 001个（P〈0.01）。结论构建的EBV LMP2-LMP1Δ融合基因能够有效表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,并能够在小鼠体内诱导出EBV特异性的CTL反应,与重组腺病毒联合使用,可以提高特异性CTL应答水平。     

人乳头瘤病毒基因工程疫苗的基础实验研究

人乳头瘤病毒(HPV)16型感染与宫颈癌的发生、发展密切相关,故研制HPW16型基因工程疫苗对预防HPV感染、控制宫颈癌的发生有重要意义。本研究构建HPV16 L1基因工程菌并进行了基础实验研究。首先采用PCR技术从3例宫颈癌组织中扩增和克隆了HPV16L1基因片段并进行测序。进而构建了pPIC3.5～HPV16L1真核表达工程菌、pQE31～HPV16L1和pGEX4T-HPV16LI原核表达工程菌及杆状病毒-昆虫细胞表达系统。经SDS-PAGE、Westem blot和电镜等手段证明了工程菌表达HPV16 L1蛋白的分子特性和免疫原性,而且,重组菌表达的HPV16 L1可以形成类病毒颗粒(VLP)。经免疫BALB/C小鼠可获得高效价特异血清,证实重组HPV16 L1蛋白具有良好的免疫原性。为进一步研制临床应用疫苗及血清学诊断试剂提供了实验基础。     

地方株HPV16L1基因诱发的小鼠体液免疫反应

目的检测pcDNA-L1的表达,评价地方株HPV16L1基因疫苗诱导的体液免疫反应.方法采用PCR技术从宫颈癌组织中获得L1基因,以pGEM-T Easy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-L1,进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析,再将L1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1（-）中,构建地方株HPV16L1基因疫苗,转染COS-7细胞,通过IFA试验验证L1蛋白的表达.用pcDNA-L1肌肉内注射方法分别于第1天、第15天和第43天免疫6周龄BABL/c小鼠,在特定时间段采血分离血清,IFA分析基因免疫在小鼠体内诱导的免疫应答,设pcDNA载体对照.结果pcDNA-L1能够在COS-7细胞中暂态表达,免疫小鼠后能检测出特异的抗体,用IFA方法在第一次免疫后的第30、60和180天均可检测到抗体;原载体免疫后未检出特异抗体.结论本实验构建的地方株HPV16L1基因疫苗可诱导产生特异性的体液免疫反应.     

共刺激分子B7-1与汉坦病毒核蛋白基因共表达载体的构建及免疫调节作用

目的:探讨共刺激分子B7-1(CD80)对汉坦病毒核蛋白基因疫苗的免疫调节作用.方法:构建双启动子共表达B7-1基因和汉坦病毒核蛋白基因的真核表达载体pcDNA 3.1-B7-S,酶切鉴定后直接肌注免疫BALB/c小鼠,同时设对照组pcDNA 3.1 空质粒接种组、pcDNA 3.1-S接种组.ELISA法检测血清特异性抗体,MTT法检测T细胞增殖反应.结果:pcDNA 3.1-B7-S接种组鼠在抗体的产生水平及淋巴细胞增殖指数上均较pcDNA 3.1-S接种组明显增高.结论:接种B7-1基因和汉坦病毒核蛋白基因的共表达质粒优于注射单目的抗原基因表达质粒,为探索增强基因疫苗的免疫作用提供了新的途径.     

小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1的构建及表达

目的:通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1,并检测其在CHO细胞中的表达。方法:通过PCR扩增FGFR1的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体包裹转染CHO细胞,Western blot检测FGFR1目的蛋白的表达。结果:经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染CHO细胞后可表达FGFR1目的蛋白。结论:成功构建的pcDNA3.1(+)-FGFR1重组质粒能在体外表达FGFR1目的蛋白。     

结核分枝杆菌PPE68基因真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的：建立结核分枝杆菌PPE68蛋白基因重组质粒的真核表达载体,为以后对PPE重组蛋白的免疫原性分析奠定基础。方法：提取结核分枝杆菌总DNA,PCR法扩增出PPE68编码基因,通过线性T克隆载体pGEM—T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）后,转染至I-IeLa细胞中表达,Westernblot鉴定表达产物。结果：PCR产物、pGEM-T—PPE68及pcDNA3．1（＋）一PPE68分别经双酶切后均获得同一大小基因片段,表达产物经Westernblot鉴定相对分子质量约为40000。结论：成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因真核表达载体,并获得了表达产物。     

汉坦病毒S基因0.7 kb片段真核载体的构建、表达及基因免疫

目的 在本室前期工作的基础上,进一步进行汉坦病毒S基因0．7kb片段的真核表达及基因免疫的研究。方法 构建汉坦病毒76－118株S基因5'端700bp片段的真核表达载体pcDNA3.1-S0.7,脂质体转染COS－7细胞,免疫荧光检测表达结果;用该质粒免疫BALB／c小鼠,并用免疫荧光法及ELISA法检测免疫的体液免疫应答效果。结果 免疫荧光检测结果表明,目的基因在COS－7细胞中获得瞬时表达;用pcDNA3.1-S0.7基因免疫小鼠可引起抗汉坦病毒核蛋白（NP）特异性的抗体应答。结论 汉坦病毒S基因0．7kb片段可刺激机体产生特异的抗汉坦病毒体液免疫应答。为进一步进行细胞免疫反应的检测及基因疫苗的研究提供实验基础。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D核酸疫苗的构建及初步研究

目的：构建、制备Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白D重组质粒DNA疫苗,初步检测其诱导机体产生体液免疫应答的效果,为HSV-1新型疫苗奠定基础。方法：用PCR的方法从HSV－1病毒基因组中扩增糖蛋白D（glycoprotein D,gD)基因,利用基因重组技术构建重组质粒;将重组质粒体外转染真核细胞COS－7,Western blotting检测表达产物;于BALB／C小鼠后腿胫前肌注射免疫,0、2周名免疫1次,100μg/次。初次免疫后0,2,4,6周眼眶采血,ELISA间接法检测抗体。结果：重组质粒酶切出相应大小片段,经测序证实为HSV－1gD序列。Western blotting证实能够在体外真核细胞中表达。免疫小鼠后,产生特异性抗体,抗体滴度1：2000。结论：HSV-1gD重组质粒DNA有可能作为HSV－1的DNA疫苗,用于防治HSV－1感染及其相关疾病。     

日本血吸虫Rho GTPase DNA疫苗及亚单位疫苗的构建和分析

目的 构建日本血吸虫大陆株Sj-Rho GTPase-like真核及原核表达重组质粒，并进行鉴定分析。方法 用PCR法将Sj-Rho GTPase-like基因从已剪切阳性克隆中扩增出来，亚克隆至pcDNA3.1和pGEX-5X-3中，分别经PCR、双酶切、测序、SDS-PAGE和Western blot等方法鉴定。结果 PCR和测序均证明Sj-Rho GTPase-like基因疫苗构建成功，重组蛋白经SDS-PAGE电泳可观察到与预期分子量相应的条带，转印后可被水牛感染血清识别。结论 成功构建了Sj-Rho GTPase-like基因的两种重组载体，为保护性免疫研究打下基础。     

小鼠β-防御素6与甲型流感病毒M2e基因融合表达及其免疫特性研究

目的构建小鼠β防御素6（mBD6）与甲型流感病毒M2蛋白胞外功能区（M2e）真核表达质粒,并研究其在真核细胞中的表达与免疫特性。方法通过重叠延伸PCR法（overlap-PCR）将M2e与mBD6通过一段多肽接头Gly4Ser融合成为mBD6-M2e。将其插入载体pcDNA3．1（＋）,构建成pcDNA3．1（＋）／mBD6-M2e。鉴定正确后,转染MDCK细胞,免疫荧光、MTT检测mBD6-M2e表达和分泌。免疫小鼠,半定量PCR检测脾细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α、CCR7表达。结果融舍基因mBD6-M2e真核表达载体pcDNA3．1（＋）／mBD6-M2e构建成功,在MDCK细胞膜上成功表达融和蛋白,转染细胞的培养上清刺激淋巴细胞增殖。免疫小鼠细胞因子表达改变。结论融合基因mBD6-M2e真核表达载体成功构建,为研究防御素在流感病毒核酸疫苗中的佐剂作用奠定了基础。     

人乳头瘤病毒6b型重组减毒沙门菌的构建及表达

目的：构建ＨＰＶ６ｂ　Ｌ１Ｅ７嵌合基因重组减毒沙门菌，为进一步粘膜免疫奠定基础。方法：用ＰＣＲ方法扩增获得ＨＰＶ６ｂ　的　Ｌ１Ｅ７　嵌合基因片段，ＴＡ　克隆后，再将Ｌ１－Ｅ７　基因克隆入ｐＴＥＴｎｉｒ１５　沙门菌表达质粒。用电转化法将重组表达质粒导入鼠伤寒减毒沙门菌Ｓ．ＢＲＤ５０９（△ａｒｏＡ，△ａｒｏＣ）中，厌氧诱导其表达，蛋白样品做ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　凝胶电泳　和ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析。结果：用ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ双酶切重组表达质粒ｐＴＥＴｎｉｒ１５６ｂＬ１Ｅ７可释放２３８９ｂｐ和１５５４ｂｐ两片段，结果与预计相符。ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ结果显示，重组沙门菌在约５６ＫＤ处有明显特异蛋白条带，而对照菌则无。结论：该重组沙门菌能特异地表达ＨＰＶ６ｂ　Ｌ１－Ｅ７　融合蛋白，人乳头瘤病毒ＨＰＶ６ｂ　Ｌ１－Ｅ７重组减毒沙门菌构建成功。     

HPV58 E2 DNA疫苗的构建及免疫原性研究

目的探讨人乳头瘤病毒58型（HPV58）早期基因E2作为DNA疫苗候选抗原的可行性。方法构建HPV58 E2真核重组表达载体pcDNA3/58E2,转染SiHa细胞,利用RT PCR检测HPV58E2 mRNA的转录。pcDNA3/58E2 DNA肌肉注射免疫BALB/C小鼠,ELISA检测小鼠血清中特异性anti HPV58E2 IgG水平。结果RT PCR结果表明,pcDNA3/58E2能够在真核细胞中有效转录HPV58E2mRNA。动物实验表明,质粒pcDNA3/58E2肌肉接种可诱导免疫小鼠产生抗E2特异性抗体。结论本研究成功构建了重组真核表达载体pcDNA3/58E2,并初步证明HPV58 E2 DNA 疫苗有良好的免疫原性。