埃可病毒6型表面特异性抗原VP1的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的原核表达埃可病毒6型表面特异性蛋白VP1,并制备其多克隆抗体。方法筛选VP1蛋白氨基酸序列中抗原性强的片段,优化基因序列,分别构建重组表达质粒p GEX-4T-2-vp1和p ET-28a-vp1。将经双酶切及测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,进行15%SDS-PAGE鉴定。将融合蛋白VP1-GST及VP1-His分别用Glutathione resin和High Affinity Ni-NTA resin进行纯化。以纯化后的VP1-His融合蛋白作为免疫原免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,以VP1-GST融合蛋白为检测抗原,间接ELISA法检测血清抗体效价,Western blot法检测血清抗体特异性。结果经双酶切及测序鉴定证明,重组质粒p GEX-4T-2-vp1和p ET-28a-vp1构建正确。VP1-GST和VP1-His融合蛋白的相对分子质量分别为38 000和19 000,两种融合蛋白分别以可溶性蛋白和包涵体形式表达,约占菌体总蛋白的60%和30%,纯化后的纯度均90%。兔抗VP1血清效价为1∶320 000,可与融合蛋白VP1-GST和VP1-His发生特异性结合。结论成功原核表达了融合蛋白VP1-His和VP1-GST,且VP1-His具有良好的免疫原性,其制备的多克隆抗体的特异性较好,为埃可病毒快速检测技术的建立奠定了基础。     

弓形虫P30蛋白抗原表位的克隆表达及纯化鉴定

目的构建表达P30蛋白抗原表位的重组质粒及工程菌,获得纯化的P30蛋白抗原表位,用于检测弓形虫特异性抗体。方法采用PCR技术,设计一对引物(P30P3、P30P4),从弓形虫基因组DNA中扩增出编码P30蛋白抗原表位的基因片段,与载体pET28a(+)连接,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDSPAGE分析。用离子交换纯化表达的P30抗原表位,用ELISA鉴定其抗原性。结果表达的P30蛋白抗原表位以包涵体形式存在,纯化的P30蛋白抗原表位片段有较好的抗原性,可用于检测弓形虫抗体。结论已成功构建了高表达P30蛋白的工程菌,为研制弓形虫抗体检测试剂或疫苗奠定了基础。     

敲除SOSSB1、SOSSB2和SOSSC基因稳定HeLa细胞株的构建

目的构建SOSSB1、SOSSB2和SOSSC基因敲除的稳定HeLa细胞株。方法分别设计并合成SOSSB1、SOSSB2和SOSSC亚基的两对靶向基因特定外显子的A、B两个单导向核酸(single guide RNA,sgRNA)及其互补链,与含BbsⅠ黏性末端的PX462载体连接,构建重组质粒。重组质粒经酶切和测序鉴定正确后,分别转染至HeLa细胞,用2μg/mL的嘌呤霉素培养筛选出稳定HeLa细胞。采用Western blot法对敲除效果进行鉴定。结果 A、B sgRNA均成功插入至PX462载体,重组质粒经酶切和测序鉴定,证明构建正确。Western blot结果表明,筛选出的SOSSB1、SOSSB2和SOSSC基因敲除稳定HeLa细胞株分别不表达SOSSB1、SOSSB2、SOSSC蛋白。结论成功构建了SOSSB1、SOSSB2和SOSSC基因敲除的稳定HeLa细胞株。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D胞外区片段在哺乳动物细胞中的表达及其免疫活性

目的在哺乳动物细胞中表达单纯疱疹病毒Ⅱ型(Herpes simplex virus type-2,HSV-2)糖蛋白D(GlycoproteinD,gD)胞外区片段,并分析其免疫活性。方法化学合成HSV-2 G株gD蛋白胞外区片断的基因序列gDt,以pCEP4作为表达载体,构建N-末端带His标签的重组表达质粒pCEP4-gDt,转染至HEK293细胞进行表达。表达的蛋白采用镍离子柱亲和层析纯化,ELISA法检测目的蛋白的抗原性。以纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多抗血清,间接ELISA法检测效价。结果重组表达质粒经PCR、双酶切和DNA测序证实构建正确;表达产物经Western blot分析,在相对分子质量约46 000处可见目的蛋白条带;纯化的重组蛋白浓度约为45μg/ml,经ELISA检测证实具有良好的抗原性,免疫小鼠5周后,血清中特异性抗体效价达5×103。结论已在哺乳动物细胞中表达了HSV-2 gD胞外区片段,其具有良好的抗原性和免疫原性,为HSV基因重组亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

丙型肝炎病毒NS5B全长基因及截短形式基因的克隆、表达及鉴定

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5B-FL、NS5B-C21和NS5B-C51重组原核表达载体,并进行目的蛋白的表达及鉴定。方法利用PCR技术扩增3种长度的NS5B基因,经BamHI和XhoI双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白,并进行纯化及鉴定。结果所构建的3种重组质粒pET-28a(+)-NS5B-FL、pET-28a(+)-NS5B-C21和pET-28a(+)-NS5B-C51,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经PCR及酶切鉴定,均能扩增或酶切出相应大小的目的基因片段,表达的6His-NS5B-FL融合蛋白主要以包涵体形式存在,而表达的6His-NS5B-C21和6His-NS5B-C51融合蛋白的可溶性明显增加。纯化的6His-NS5B-C21蛋白未发生降解,6His-NS5B-FL和6His-NS5B-C51蛋白发生了部分降解。纯化后的3种蛋白均能与丙肝患者血清发生反应。结论已成功构建了3种NS5B基因的重组表达载体,并获得了目的蛋白表达,为进一步抗HCV药物的筛选奠定基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白的高效表达及纯化

用新型表达载体PGEX4T－2在大肠杆菌内高效表达了丙型肝炎病毒核心蛋白。所表达的核心蛋白融合有谷优甘肽转移酶，用Sepharose4B—GSH凝胶一步亲和层析纯化即可获得高纯度的核心蛋白、该蛋白具有较好的抗原性和特异性。     

单纯疱疹病毒2型表面糖蛋白D亚单位疫苗免疫佐剂的筛选及免疫方案优化

目的筛选单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus type 2,HSV-2)表面糖蛋白(glycoprotein)D2(g D2)亚单位疫苗的免疫佐剂,对免疫剂量、免疫次数等免疫方案进行优化。方法使用Alum佐剂、Poly I:C佐剂及Alum+Poly I:C混合佐剂,分别配伍不同剂量(2、5、10μg)的gD2蛋白,共制成9种注射制剂,经后腿肌肉注射免疫9组雌性BALB/c小鼠,分别于初次免疫后第28和42天各加强免疫1次,于初次免疫后28 d及第2、3次免疫后14 d,经眼眶静脉窦取血,分离血清,ELISA法检测特异性抗g D2抗体效价;脱颈椎处死小鼠,分离研磨脾脏后,获得脾细胞,加入gD2抗原刺激培养71 h后,收集细胞上清,应用CBA试剂盒测定细胞因子(IL-2、IFNγ、TNF-α)浓度;确定最佳免疫方案。结果初次免疫后28 d,各组总抗体效价偏低,混合佐剂(Alum+Poly I:C)配伍10μg抗原组小鼠血清抗体效价最高,但动物个体差异大。第2次免疫后14 d,各组小鼠血清抗体效价较第1次免疫显著增高;佐剂及抗原剂量对抗体效价影响显著,其中Poly I:C佐剂配伍10μg抗原组小鼠抗体效价及细胞因子分泌水平综合最高。末次免疫后14 d,小鼠血清中抗体效价较第2次免疫再次升高,动物个体间效价差异缩小,混合佐剂组效价最高;各组细胞因子分泌水平较第2次免疫略有增高,混合佐剂配伍2μg抗原组分泌高水平的IL-2、IFNγ、TNF-α。结论小鼠免疫模型中,使用Alum+Poly I:C混合佐剂较使用任一单独佐剂可产生最佳免疫效果,最佳免疫组为混合佐剂配伍2μg抗原组,最佳免疫次数为3次,第1和2次免疫间隔28 d,第2和第3次免疫间隔14 d,最佳免疫剂量为2μg/只小鼠。     

人巨细胞病毒gp52蛋白基因片段的克隆及表达

目的为获得高表达人巨细胞病毒 ｇｐ５２蛋白基因的工程菌。方法通过计算机分析,筛选出巨细 胞病毒蛋白ｇｐ５２中优势抗原决定簇,用ＰＣＲ技术扩增克隆了含强抗原决定簇的基因片段。将克隆的基因片段插 入表达载体ｐＥＴ２８（ａ）内,转化大肠杆菌ＢＬ２１,经Ｓｅｐｈａｒｅｒｙ１ Ｓ－２００分子筛及Ｎｉ－ＮＴＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ螯合层析进行纯化。结 果获得的工程菌所表达的 ｇｐ５２蛋白片段相对分子质量约为 ２１ ０００,约占菌体可溶性蛋白的 ２８％。获得的表达蛋 白纯度达９５％,电泳显示单一条蛋白带,ＥＬＩＳＡ分析证实有较强的抗原性和较好的特异性。结论本研究对人巨细 胞病毒感染,尤其是对孕妇及献血员等感染的检测有重要意义。     

肺炎链球菌表面蛋白A的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的原核表达、纯化肺炎链球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A,Psp A),并制备多克隆抗体。方法应用ANTHEWIN、DNAstar等分子生物学软件,对Psp A氨基酸序列进行分析,筛选出抗原表位富集区(第33~109个氨基酸),选用原核生物偏爱的密码子优化基因序列,化学合成全新的基因序列pspa,插入质粒p GEX-4T-2和p ET28a(+)中,构建重组表达质粒p GEX-4T-2-pspa和p ET28a(+)-pspa,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。分别纯化带有GST标签和His标签的Psp A重组蛋白GST-Psp A和His-Psp A,以His-Psp A作为免疫原,经背部多点免疫新西兰大耳白兔,间接ELISA法检测血清抗体效价,Western blot法检测血清抗体特异性。结果两种重组表达质粒p GEX-4T-2-pspa和p ET28a(+)-pspa经双酶切鉴定构建正确;表达的两种重组蛋白GST-Psp A和His-Psp A相对分子质量分别约为33 000和18 000,均为可溶性表达,纯化后目的蛋白条带均无降解,纯度约为95%,蛋白浓度分别为2和0.2 mg/ml;制备的兔抗血清效价较高,可达1∶200 000,且特异性较好。结论原核表达并纯化了肺炎链球菌Psp A融合蛋白,并制备了特异性良好的高效价兔抗血清,为下一步建立肺炎链球菌快速检测技术奠定了基础。     

重组人巨细胞病毒gp52蛋白的纯化及鉴定

目的 对大肠杆菌表达的人巨细胞病毒ｇｐ５２蛋白纯化及鉴定。方法 将表达ｇｐ５２蛋白的菌体超 声裂解后,离心取上清,经ＤＥＡＬＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ阴离子柱纯化,收集纯化的ｇｐ５２蛋白,再上Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ阳离子柱纯 化,收集纯化的ｇｐ５２蛋白,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测其纯度,用Ｗｅｓｔｅｍ　ｂｌｏｔ和 ＥＩＬＳＡ检测其抗原性。结果 纯化的ｇｐ５２蛋 白纯度达８５％以上,并有较好的抗原性和特异性。结论 制备的重组ｇｐ５２蛋白可用于人巨细胞病毒抗体的检测 等研究。