猪CR1-like蛋白酵母双杂交诱饵质粒的构建及鉴定

为了研究猪红细胞免疫粘附病原体的分子机制,筛选能与猪红细胞类补体受体I型(CR1-like)蛋白发生相互作用的蛋白,将CR1-like36和Cr1-like811基因与pGBKT7载体连接后,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CR1-like36和pGBKT7-CR1-like811。转化入酵母细胞Y2HGold中,检测融合蛋白的表达及其对酵母细胞的毒性和自激活现象。结果表明,CR1-like基因成功连接到pGBKT7载体,重组质粒表达的融合蛋白对酵母细胞无毒性作用,也无自激活现象。成功构建了符合酵母双杂交系统要求的诱饵质粒pGBKT7-CR1-like36和pGBKT7-CR1-like811,为课题组后期研究猪红细胞CR1-like发挥免疫粘附功能的分子机理奠定基础。     

利用酵母双杂交系统筛选TRADD的互作牛分枝杆菌蛋白

为研究牛分枝杆菌抑制肿瘤坏死因子介导的细胞凋亡来逃避宿主免疫反应的机制,本试验采用酵母双杂交系统在牛分枝杆菌中筛选可与肿瘤坏死因子受体1相关死亡域蛋白（TRADD）相互作用的蛋白。通过限制性内切酶Sau3AⅠ部分消化牛分枝杆菌基因组,回收片段随机插入pGADT7载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建牛分枝杆菌基因组文库。PCR扩增人tradd基因,将扩增产物克隆于pGBKT7载体上,构建重组诱饵质粒pGBKT7-tradd,转化酵母菌Y2HGold。用诱饵质粒pGBKT7-tradd对牛分枝杆菌基因组文库进行筛选,以获得与TRADD互作的阳性候选克隆;提取阳性候选克隆中的质粒,经测序和同源性比对分析,获得与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白的生物学信息。结果显示,构建的文库滴度为2×10⁶ CFU,平均插入片段在1.5 kb左右,文库重组率>95%。经Western blotting验证,诱饵质粒pGBKT7-tradd可在酵母菌中表达诱饵蛋白TRADD,且TRADD的表达对酵母菌无毒性,不会在酵母菌中自激活。应用酵母双杂交系统初步筛选出20个与TRADD互作的阳性克隆,经复筛、测序和BLAST对比,最终发现7个基因序列。本研究应用酵母双杂交技术成功筛选到7个与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白,为进一步研究牛分枝杆菌对细胞凋亡的抑制机制提供线索。     

环形泰勒虫TRAP-A蛋白酵母双杂交诱饵质粒的构建与鉴定

为了筛选出环形泰勒虫TRAP蛋白在虫体入侵媒介蜱唾液腺过程中相互作用蜱源蛋白,构建了能够用于酵母双杂交筛选系统的重组诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A。本研究以环形泰勒虫裂殖体为材料,根据环形泰勒虫TRAP-A结构域的基因序列设计引物,经过PCR扩增获得576 bp的基因片段,将其连接到线性化载体pGBKT7上。经双酶切鉴定和序列分析以及重组诱饵质粒在酵母双杂交系统中的自激活、细胞毒性及其表达情况检测,结果显示,本研究成功构建了酵母双杂交重组诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A,构建的诱饵质粒对Y2HGold酵母菌无自激活活性和细胞毒性,且构建的诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A可以在Y2HGold酵母菌内正确表达。表明所构建的诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A可以用于筛选小亚璃眼蜱唾液腺酵母双杂交c DNA文库,获得可能与环形泰勒虫TRAP-A蛋白相互作用的蜱源蛋白。     

利用酵母双杂交技术筛选和鉴定非洲猪瘟病毒E120R蛋白的互作宿主蛋白

【目的】 探讨非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）衣壳蛋白E120R在病毒感染中的作用，确定与E120R蛋白互作的宿主蛋白。【方法】 将ASFV分离株CADC_HN09株E120R基因合成并克隆于pGBKT7表达载体，获得pGBKT7-E120R诱饵质粒，同时构建E120R基因截短表达质粒pGBKT7-E120R-1（1－61位氨基酸）和pGBKT7-E120R-2（62－122位氨基酸）。经毒性和自激活性检测后，通过酵母双杂交技术对骨髓巨噬细胞（BMDMs） cDNA均一化酵母文库进行初步筛选，以获得与ASFV E120R蛋白互作的蛋白。通过NCBI数据库进行序列比对并经免疫共沉淀试验验证，确定互作的宿主蛋白。筛选的宿主蛋白经webgenstal在线分析网站初步进行GO功能和KEGG通路富集分析，以确定所筛选的宿主蛋白参与的生物过程与信号通路。【结果】 诱饵质粒pGBKT7-E120R-2无毒性和自激活性，可用于文库筛选。通过酵母双杂交系统从BMDMs cDNA均一化酵母文库中初步筛选到46个阳性克隆并进行回转验证，经NCBI数据库序列比对分析共获得29个宿主蛋白。免疫共沉淀试验结果显示，多聚胞嘧啶结合蛋白2（PCBP2）和干扰素刺激基因15（ISG15）均与E120R蛋白存在互作。GO功能富集分析表明，所筛选的宿主蛋白可参与代谢过程、生物调节、应激反应等生物过程；KEGG通路富集分析表明，这些宿主蛋白可参与抗原呈递、铁死亡和坏死性凋亡等多条信号通路。【结论】 ASFV E120R蛋白可与宿主免疫应答、细胞死亡等信号通路相关的多种宿主蛋白互作，为进一步研究ASFV E120R蛋白在病毒感染过程中的作用提供了重要理论依据。     

鹅细小病毒VP2和VP3蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及验证

为筛选与鹅细小病毒VP2和VP3蛋白相互作用的鹅胚成纤维细胞蛋白,构建VP2和VP3蛋白的诱饵载体pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3。从pGEX-4T-VP1质粒中PCR扩增VP2和VP3基因,克隆至pMD-18T载体中,经测序验证鉴定后定向克隆到酵母双杂交载体pGBKT7中。将2个重组诱饵载体经PCR、酶切和测序验证后分别转化酵母菌H2YGold中,检测其在酵母细胞中有无自激活和毒性作用。结果表明:成功构建了pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3诱饵载体,且其对报告基因无自激活作用,对酵母细胞无毒性。由此说明,诱饵载体pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3可用于酵母双杂交系统筛选与VP2和VP3蛋白相互作用的细胞结合蛋白。     

酵母双杂交诱饵蛋白日本血吸虫抱雌沟蛋白重组质粒的构建及鉴定

为筛选与血吸虫抱雌沟蛋白相互作用的因子,本研究以抱雌沟蛋白（gynecophoral canal protein ofSchistosoma japonicum,SjGCP）为诱饵蛋白构建了用于酵母双杂交筛选系统的重组质粒。根据日本血吸虫抱雌沟蛋白的基因序列设计引物,经过PCR扩增、酶切回收,与经相应酶切的线性化载体pBGKT7-BD连接构建重组质粒。随后将重组质粒pGBKT7-BD-SjGCP转化酵母菌株,测定融合蛋白BD-SjGCP在酵母菌中的自激活活性、对酵母菌生长的影响及在酵母中的表达情况。结果显示构建的重组诱饵蛋白质粒pGBKT7-BD-SjGCP能够在酵母细胞内正确表达,没有独自激活报告基因表达的活性,且其表达对酵母细胞没有毒性,不影响酵母细胞的生长。可见,重组质粒pGBKT7-BD-SjGCP可用于筛选与血吸虫抱雌沟蛋白相互作用的物质。     

蓝舌病病毒衣壳蛋白VP2、VP5、VP7酵母双杂交诱饵质粒的构建及鉴定

蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)的结构主要由3层衣壳蛋白组成,其中VP2、VP5蛋白构成了BTV的外层衣壳,VP7蛋白构成了BTV的中间衣壳,最内层衣壳则由VP3蛋白构成。VP2、VP5及VP7蛋白在BTV侵染宿主细胞的过程中起着非常重要的作用。为了研究BTV与宿主细胞相互作用的分子机制,本研究将BTV的VP 2、VP 5、VP 7基因分别克隆到pGBKT7载体中,成功构建了pGBKT7-VP2、pGBKT7-VP5与pGBKT7-VP73个诱饵质粒,且通过自激活和毒性验证,证明所构建的3个质粒均无自激活作用,对酵母细胞无毒性作用。本研究为今后利用酵母双杂交筛选VP2、VP5、VP7蛋白中与宿主细胞相互作用的蛋白做好了铺垫,为深入研究BTV与宿主细胞的相互作用奠定了基础。     

鸭肠炎病毒UL24/C基因酵母双杂交诱饵载体构建及鉴定

为构建DEV UL24/C蛋白的酵母双杂交的诱饵载体,本研究以DEV CHv株基因组DNA为模板,经一步法克隆构建pGBKT7-UL24/C诱饵质粒,质粒转化酵母菌株后进行自激活活性检测、免疫印迹检测和毒性检测。结果显示,诱饵质粒pGBKT7-UL24/C插入片段大小为510 bp,且未发生基因突变;pGBKT7-UL24/C质粒转化Y2HGold菌株后的自激活检测显示诱饵菌株无自激活活性,免疫印迹检测表明该诱饵菌株成功表达DEV UL24/C蛋白,毒性检测表明该诱饵蛋白对宿主菌Y2HGold无毒性作用。综上表明,未研究正确构建了UL24/C基因酵母双杂交诱饵载体Y2HGold(pGBKT7-UL24/C),为筛选与DEV UL24蛋白相互作用蛋白、探究DEV UL24蛋白功能及分子机制奠定了基础。     

禽呼肠孤病毒σA基因酵母双杂交诱饵载体的构建与鉴定

为了筛选与禽呼孤病毒σA基因相互作用的宿主蛋白,本试验应用酵母双杂交技术构建禽呼孤病毒σA基因的诱饵载体pGBKT7-σA。从禽呼肠孤病毒S1133标准毒株抽提RNA,采用RT-PCR方法扩增得到σA基因片段,将其连接到诱饵载体pGBKT7上,把通过测序的重组诱饵载体命名为pGBKT7-σA。将重组诱饵载体转化酿酒酵母Y2HGold后,把不同浓度的诱饵载体转化液涂布在营养缺陷型培养基上,观察该重组诱饵载体在酵母细胞中有无毒性作用和自激活现象。结果显示,酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-σA构建成功,且对酿酒酵母无毒性和自激活现象。本研究为进一步利用酵母双杂交技术筛选与σA蛋白互作的宿主蛋白奠定了基础。     

牛源犬新孢子虫NcAMA1基因酵母双杂交诱饵载体构建及鉴定

为筛选牛源犬新孢子虫AMA1与虫体互作的靶蛋白,构建NcAMA1基因酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-AMA1。本试验应用RT-PCR技术从虫体总RNA中扩增了去除跨膜螺旋的AMA1基因,定向克隆到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组诱饵载体转化酵母Y2H,并验证其在酵母细胞中毒性作用和有无自激活现象。结果显示:本试验成功构建了诱饵载体pGBKT7-AMA1,并证明其对酵母细胞无毒性,且对报告基因无自激活。结果表明:诱饵载体pGBKT7-AMA1可用于酵母双杂交系统筛选与虫体互作的宿主蛋白。     

Construction and Identification of Yeast Two-hybrid Bait Plasmids of Capsid Proteins VP2, VP5 and VP7 of Bluetongue Virus

The structure of bluetongue virus(BTV) was consisted of three layers of capsid proteins, VP2 and VP5 proteins consisted the outer capsid of BTV, VP7 protein consisted the middle capsid of BTV, VP3 consisted the inner capsid of BTV.When BTV infected host cells, VP2, VP5 and VP7 proteins of BTV played important roles in the process of infecting host cells.In order to study the molecular mechanism of interaction between BTV and host cells, we cloned VP 2, VP 5 and VP 7 genes into pGBKT7 vector, three recombinant bait plasmids pGBKT7-VP2, pGBKT7-VP5 and pGBKT7-VP7 were successfully constructed, and then the self-activation and toxicity of the bait plasmids were tested.The results showed that three bait plasmids all had no self-activation and toxicity to yeast cells.This research made a steppingstone for the screening of host-cell protein interacting with VP2, VP5 and VP7 proteins using yeast two-hybrid system, and laid a foundation for investigating the interaction between BTV and its host cells.     

布鲁氏菌分泌蛋白BPE005的亚细胞定位及与宿主细胞互作蛋白的筛选

【目的】 分析布鲁氏菌分泌蛋白BPE005的蛋白结构及细胞定位,筛选宿主细胞内与其存在相互作用的靶蛋白,为后续研究BPE005的生物学功能奠定基础。【方法】 通过生物信息学软件对BPE0005的蛋白结构进行初步分析;构建PDRRED2-C1-BPE005重组荧光定位载体,转染人胚肾上皮细胞293T,通过扫描激光共聚焦显微镜观察BPE005的细胞定位;构建PGBKT7-BPE005诱饵载体,验证诱饵载体是否有细胞毒性和自激活现象;以小鼠巨噬细胞RAW264.7 mRNA的cDNA文库为AD文库菌液,检测文库滴度,通过酵母双杂交系统筛选宿主细胞内与BPE005相互作用的靶蛋白。【结果】 布鲁氏菌分泌蛋白BPE005属于疏水性蛋白,内含有大量的无规则卷曲、α-螺旋和延伸链。成功构建PDRRED2-C1-BPE005荧光定位载体和PGBKT7-BPE005诱饵蛋白载体,BPE005定位于宿主细胞核。PGBKT7-BPE005诱饵蛋白载体无酵母细胞毒性和自激活现象,AD文库菌液滴度>2×10⁷/mL,筛选出4个宿主细胞内与BPE0005存在相互作用的蛋白:RNA聚合酶Ⅱ多肽G、补体因子H、鸟苷酸环化酶2G及颗粒蛋白。经复筛、测序、BLAST比对、一对一验证后,最终筛选出1个在宿主细胞内与BPE005具有较强相互作用的靶蛋白(RNA聚合酶Ⅱ多肽G)。对该蛋白的作用网络分析表明,RNA聚合酶Ⅱ多肽G对宿主细胞内mRNA的转录和合成具有重大影响。【结论】 布鲁氏菌分泌蛋白BPE005定位于宿主细胞核,在宿主细胞内可与RNA聚合酶Ⅱ多肽G产生较强相互作用,对进一步阐明布鲁氏菌感染过程中关键效应分子的作用机制具有指导意义。     

酵母双杂交筛选人白细胞文库中与A型流感病毒PB1-F2相互作用的蛋白

利用酵母双杂交技术筛选白细胞文库中与A型流感病毒PB1-F2相互作用的宿主蛋白,为研究PB1-F2蛋白的功能提供依据。构建pGBKT7-PB1-F2诱饵重组载体,在证实诱饵蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛选人白细胞文库中与PB1-F2相互作用的细胞蛋白。对阳性克隆进行测序和生物信息学分析,并在酵母细胞内验证蛋白的相互作用。Western blot结果表明,酵母表达载体pGBKT7-PB1-F2在酵母中成功表达PB1-F2融合蛋白。酵母双杂交筛选并验证,获得了8个与流感病毒PB1-F2蛋白相互作用的宿主蛋白。本研究有助于在分子水平上探索PB1-F2蛋白的新功能,为揭示流感病毒的致病机理奠定基础。     

羊口疮病毒ORFV114蛋白生物信息学分析、真核表达及亚细胞定位

【目的】 对羊口疮病毒（Orf virus,ORFV） ORFV114蛋白进行生物信息学分析、转录动力学、真核表达及亚细胞定位研究。【方法】 使用DNAStar软件对ORFV-JS株ORFV114基因进行序列比对分析;分别使用在线网站ExPASy、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、SOPMA、SWISS-MODEL对ORFV114蛋白进行理化性质分析,以及跨膜区、信号肽、结构预测;在阿糖胞苷（cytarabine,Arac）存在或不存在的情况下,于ORFV感染HeLa细胞后多个时间点收获细胞,RT-PCR扩增ORFV114基因,确定ORFV114蛋白的动态转录水平;PCR扩增ORFV114基因,将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建pEGFP-ORFV114重组质粒,经酶切、测序鉴定正确后,经脂质体Lipofectamine 3000瞬时转染HEK293细胞,通过Western blotting鉴定ORFV114-EGFP融合蛋白的表达;将pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV114重组质粒瞬时转染HeLa细胞,24 h后使用Hoechst 33342对细胞核染色,倒置荧光显微镜下观察ORFV114蛋白的亚细胞定位。【结果】 ORFV-JS株ORFV114基因大小为1 041 bp,在ORFV毒株中高度保守;ORFV114蛋白包含346个氨基酸,预测分子质量大小为38 ku;ORFV114为弱亲水性不稳定蛋白,无跨膜区域,无信号肽;其二级结构由无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,分别占45.09%、25.14%、21.68%和8.09%;在Arac存在或不存在的情况下,ORFV114的转录在ORFV感染后2 h即可被检测到,且随感染时间的延长转录水平不断提高,即Arac并未抑制ORFV114转录,ORFV114为ORFV早期基因;成功构建了pEGFP-ORFV114重组质粒,ORFV114-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中成功表达,融合蛋白大小约65 ku;ORFV114蛋白主要定位在HeLa细胞的细胞质中且呈点状分布。【结论】 本研究成功地对ORFV114蛋白进行了转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位,为进一步探索ORFV114蛋白功能及筛选互作蛋白奠定基础。     

抗犬细小病毒纳米抗体的制备及其中和活性鉴定

【目的】 建立抗犬细小病毒（CPV）纳米抗体（Nb）库,从中筛选出具有中和活性的Nb。【方法】 以高免比格犬脾脏组织cDNA进行重链可变区（VH）扩增,与pBSD载体连接,构建pBSD-Nb库。结合细菌展示、流式细胞仪检测,在pBSD-Nb库中筛选高亲和力的Nb,获得阳性克隆并测序。利用Primer Premier 5.0软件设计Nb基因的上、下游引物,将阳性克隆质粒中Nb基因片段进行PCR扩增。利用pET-27b表达目的蛋白,通过变性、复性手段纯化目的蛋白,用SDS-PAGE分析纯化后的蛋白。将Nb包被96孔板,采用ELISA法检测Nb对CPV的亲和力。通过病毒微量中和试验检测Nb抑制CPV感染猫肾细胞（F81）的情况。【结果】 PCR扩增结果显示,在384 bp处可见明显条带,与预期大小相符,证明pBSD-Nb库构建成功。细菌展示后,流式细胞术检测结果显示,有9株阳性峰偏移率高的Nb,分别命名为Nb1、Nb2、Nb3、Nb4、Nb5、Nb6、Nb7、Nb8和Nb9。PCR扩增9株Nb基因片段,获得384 bp的条带。SDS-PAGE结果显示,在约14 ku处有一条带,说明成功获得纯化蛋白。ELISA检测结果表明,9株Nb中有6株Nb对CPV的亲和力较强。体外病毒中和试验检测发现,1株Nb能够中和病毒,抑制F81细胞病变,中和病毒的有效浓度为0.05 mg/mL。【结论】 本研究成功建立pBSD-Nb库,筛选出6株对CPV具有高亲和力的Nb,并成功获得1株具有中和活性的Nb,为CPV治疗性抗体制剂的开发提供了新的思路。     

关中奶山羊FGF2基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

【目的】对关中奶山羊成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）基因进行克隆及生物信息学分析，并检测其在山羊各组织中的表达差异，为后续探究该基因的功能奠定基础。【方法】以关中奶山羊乳腺cDNA为模板，采用RT-PCR技术扩增并克隆关中奶山羊FGF2基因完整CDS区序列，进行相似性比对、系统发育树构建及生物信息学分析；运用实时荧光定量PCR方法检测FGF2基因在关中奶山羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背最长肌、肺脏、乳腺和卵巢组织中的表达情况。【结果】关中奶山羊FGF2基因编码区长468 bp，可编码155个氨基酸，分子质量为17.26 ku，理论等电点为9.58，其中含量最高的是甘氨酸，占10.3%。相似性比对结果表明，关中奶山羊FGF2氨基酸序列与人、牛、马、兔、绵羊、虎鲸和野猪的相似性分别为98.7%、99.4%、100.0%、98.7%、99.4%、99.4%和62.6%。系统进化树显示，FGF2基因在不同物种间具有高度保守性，与马的亲缘关系最近。关中奶山羊FGF2蛋白不稳定指数为38.39，属于稳定亲水性蛋白质，不含跨膜结构和信号肽；FGF2蛋白二级结构含有α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲，分别占比10.32%、14.19%、30.97%、44.52%。蛋白质互作预测分析显示，FGF2蛋白与FGFR、KDR、FGF1、FGFR4、MET和FGFR1等与乳腺生长发育相关的蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR检测到关中奶山羊FGF2基因在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背最长肌、肺脏、乳腺和卵巢中均有表达，在乳腺中表达水平最高，其次为卵巢，在背最长肌中的表达水平最低。【结论】关中奶山羊FGF2基因CDS区序列长468 bp，编码155个氨基酸，为亲水蛋白，二级结构以延伸链和无规则卷曲为主。FGF2基因在关中奶山羊泌乳高峰期的不同组织中均有表达。本试验结果为进一步探究FGF2基因在关中奶山羊乳腺发育中的作用及其具体功能提供了参考。