犬瘟热病毒跨物种传播的研究进展

犬瘟热病毒(canine distemper virus, CDV)是具有高度传染性的病原。最初被描述为感染家犬的病原,现已被认为是一种可感染多种食肉动物的病毒,可导致被感染宿主发病,甚至大量死亡,并且容易在易感宿主之间跨种属传播。已有的研究表明,CDV暴发对野生生物种群的影响越来越大,并已经威胁到某些濒危野生物种的生存。另有研究表明,CDV甚至有成为人畜共患病原的可能。本研究拟对CDV在易感宿主范围扩大、自身基因突变和进入新宿主动态途径等方面展开综述,旨在为研究CDV跨物种传播的研究提供参考。     

大熊猫犬冠状病毒部分S基因的克隆与全S基因序列分析

从重庆某动物园死亡的大熊猫肝脏中分离到一株病毒，经鉴定为犬冠状病毒（命名为CCV DXMV）。本实验根据CCV K378和CCV Insavc-1株基因序列设计合成了普通PCR引物SF1-SR1和SF2-SR2，以及半套式引物SF3-SR3、SR13、SF13、SF4-SR4和SF14，分段扩增了CCVDXMV株部分S基因，得到了368bp、792bp、737bp、1178bp和985bp5个基因片段。将纯化的RCR产物分别克隆到pGEM—T载体中，通过筛选和鉴定，获得了5个阳性重组质粒。将重组质粒送生物公司测序，将测得的基因序列与先前测定的该株病毒部分S基因序列，拼接成全S基因序列，并与其它株CCV及TGEV HN2002和FIPV79—1146株的S基因序列进行分析比较，绘制进化树。结果表明，该株病毒与CCV K378株的同源性最高，达到99．4％；而与CCV 23／03株的同源性最低，为56．9％；与FIPV和TGEV分别有90．4％和82．1％的同源性。     

A型流感病毒PB1-F2蛋白与蛋白激酶R相互作用研究

为研究A型流感病毒的重要毒力因子PB1-F2对蛋白激酶R(PKR)的调控机制,通过纯化GST-PB1-F2融合蛋白,利用GST pull-down试验证实了PB1-F2与PKR发生相互作用;采用免疫荧光试验进一步验证了二者的相互关系;实时荧光定量PCR表明PB1-F2能负调控PKR及IL-6的mRNA水平;采用siRNA干扰PKR基因的表达后,PB1-F2抑制IL-6的mRNA转录作用更显著。进一步运用蛋白免疫印迹方法检测了PB1-F2对PKR及其底物eIF-2α蛋白磷酸化水平的影响,显示过表达PB1-F2后,PKR及eIF-2α的磷酸化表达水平明显下调。本研究表明PB1-F2与PKR相互作用而抑制PKR磷酸化活化,并通过PKR调控IL-6的表达,为探索PB1-F2的未知生物学功能提供了重要信息。     

细胞骨架抑制剂对狂犬病病毒感染人神经瘤细胞的影响

为检测细胞骨架抑制剂对狂犬病病毒(RABV)感染细胞的抑制作用,筛选了秋水仙素(Col)和细胞松弛素D(CytoD)2种骨架特异性抑制剂在人神经瘤细胞SH-SY5Y上的适宜浓度,探讨其对RABV感染及复制的影响。结果表明:随着细胞骨架抑制剂浓度的升高,微管和微丝的破坏加剧;当Col浓度分别为0.065 mmol/L和0.130 mmol/L及CytoD浓度分别为0.25μg/mL和0.50μg/mL时,微管、微丝结构及细胞活力均与对照组无显著差异(P0.05),2种骨架抑制剂对RABV的感染及复制均有抑制作用。通过对RABV培养物的OD值和G基因mRNA的定量检测,发现CytoD对RABV感染的抑制作用较Col更明显,Col对RABV复制的抑制作用较CytoD更明显。     

A型流感病毒PB1-F2蛋白的原核表达、纯化及鉴定

对A型流感病毒PB1-F2蛋白进行了原核表达及纯化,获得了谷胱甘肽硫转移酶(GST)-PB1-F2融合蛋白,以用于研究流感病毒PB1-F2蛋白的功能及分子作用机制。以RT-PCR方法扩增PB1-F2基因,将其克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上。重组质粒pGEX-6P-1-PB1-F2转化大肠杆菌(Es-cherichia coli)菌株BL21,并诱导表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western blot试验鉴定。结果显示,大肠杆菌细胞经诱导,表达出了相对分子量约为36kDa的蛋白,与GST-PB1-F2融合蛋白大小相符;Western blot鉴定显示,该融合蛋白能够被抗GST的抗体特异性识别。试验在大肠杆菌表达系统中成功表达纯化了GST-PB1-F2融合蛋白,为深入研究PB1-F2蛋白的功能奠定了基础。     

狂犬病病毒入胞途径的初步探索

狂犬病病毒(rabies virus,RABV)具有高度嗜神经性,通过识别细胞膜上特异性受体并借助内吞途径侵入细胞。为了探究其入胞途径,本研究在人神经瘤细胞(SH-SY5Y)和非洲绿猴肾上皮细胞(Vero)上,应用氯丙嗪(chlorpromazine)、制霉菌素(nystatin)、巴弗洛霉素a1(bafilomycin a1)、dynasore等抑制剂处理细胞后,进行RABV感染,通过检测病毒N基因拷贝数和RABV效价,对RABV入胞途径进行初步探究。结果显示,RABV通过网格蛋白介导、低pH值和发动蛋白(dynamin)依赖途径侵入SH-SY5Y和Vero细胞,但不通过小窝蛋白依赖途径入胞。这些结果为进一步研究狂犬病病毒感染机制和药物靶点研究提供了新的数据。     

狂犬病病毒M蛋白胞内合成和分布初步研究

【目的】狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)是一种主要由核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)、依赖RNA的RNA聚合酶蛋白(L)5种结构蛋白组成的高度嗜神经性病毒。RABV基因组RNA与N蛋白、P蛋白和L蛋白组成核糖核蛋白复合体(RNP),M蛋白在调控RABV病毒结构蛋白的合成和装配过程中起重要作用。但RABV不同毒株M蛋白胞内合成、分布场所及其是否存在差异尚不清楚。研究不同RABV毒株M蛋白与内质网、高尔基体以及M蛋白与G蛋白、M蛋白与RNP在N_2A和BHK细胞内的共定位,以期确定RABV M蛋白的胞内合成途径和分布场所。【方法】测定RABV不同毒株(CVS-11、SRV-9、PB4)在N_2A或BHK细胞的TCID_(50),以相同的MOI接毒,通过免疫荧光研究M蛋白与内质网、高尔基体的共定位,以及M蛋白与G蛋白、M蛋白与RNP(为N蛋白代表)的共定位。【结果】RABV不同毒株效价存在一定差异。在N_2A和BHK细胞中,不同RABV毒株的M蛋白与内质网、高尔基体均存在共定位;M蛋白与G蛋白、M蛋白与N蛋白也存在共定位,但M蛋白与G蛋白主要共定位于内质网、高尔基体上,而M蛋白与N蛋白主要共定位在胞浆中。【结论】RABV M蛋白在胞内主要通过内质网-高尔基体途径合成加工。研究结果明确了RABV M蛋白胞内合成分布部位,为进一步研究RABV病毒粒子的装配和出芽过程丰富了数据。     

鸡痘鹌鹑化弱毒在犊牛睾丸细胞上的适应性试验

鸡痘鹌鹑化弱毒不仅能够在鸡胚成纤维细胞上复制,而且经过试验也可以在犊牛睾丸细胞(以下简称BTC)上复制。本试验结果表明：鸡痘鹌鹑化弱毒在BTC上培养传代至第6代后,细胞产毒效价达10^-55EID50／0．2mL左右,达到了《兽用生物制品规程》的制苗标准。这为试验用BTC代替SPF鸡胚生产鸡痘活疫苗提供了重要依据。     

几种糖对4℃贮存狂犬病病毒稳定性的影响

为探讨糖类作为狂犬痛液体疫苗保护剂的可行性,本研究将海藻糖、蔗糖和葡萄糖分别加入到狂犬病病毒(RV)培养物中,使终浓度为5%、10%和20%的悬液,以不加糖的RV培养物为对照,分别测定4℃贮存3、7、10、15、30 d后的TCID50/mL和ELISA值.结果显示,TCID50/mL和ELISA值均随着存放时间的延长而逐渐降低;当含5%和10%海藻糖、5%蔗糖时,贮存3 d后的TCID50/mL值比对照组高10倍以上,其中在含5%海藻糖时,TCID50/mL达10-8.5,表明RV滴度可以很好保持;而在加入葡萄糖各组的TCID50/mL和ELISA值均明显低于对照组.