重组人乙型肝炎病毒核糖核酸酶H基因工程菌的生物活性研究

目的：研究表达乙型肝炎病毒核糖核酸酶H(HBV—RNaseH)工程菌的发酵条件。方法：采用摇瓶发酵，研究不同宿主菌对表达HBV—RNaseH的效果；同时对培养基、诱导时期、诱导时间、初始pH等发酵条件以及质粒稳定性进行研究。结果：选用E coliBL21为宿主菌，在LB培养基中培养至A600为0．6时，诱导表达4．5h，HBV—RNaseH表达量最高达33．6％。而且重组质粒具有良好的分离稳定性和结构稳定性。结论：此发酵条件可以比较好的提高HBV—RNaseH的表达量，为发酵规模的扩大奠定了基础。     

不同培养基和寄主菌对白介素—Ⅱ工程菌表达的影响

本文比较了LB、M9CA 两种培养基和大肠杆菌 DH5α和 RRl 寄主菌,对白介素-Ⅱ(IL-Ⅱ)工程菌表达的影响。比较结果表明,M()CA培养基和DH5α寄主菌效果较好,其表达 IL-Ⅱ的蛋白量占整个菌体蛋白量的18%,占包涵体蛋白量的53%。     

大肠杆菌菌蜕作为核酸疫苗载体的实验方法研究

目的制备大肠杆菌DH5α菌蜕,并用其装载核酸片段以及质粒DNA,体外转染抗原递呈细胞,探讨其作为DNA疫苗载体的可能性。方法将构建有φX174噬菌体裂解蛋白的温控型表达质粒pHH43转化入大肠杆菌DH5α中,诱导细菌裂解制备大肠杆菌DH5α菌蜕,利用制备的DH5α菌蜕装载核酸片段,并摸索出较好的装载方法用于质粒DNA的装载,然后转染巨噬细胞RAW264.7,观察转染效果。结果成功制备了大肠杆菌DH5α菌蜕,细菌的裂解效率可达97.8%,对核酸片段和质粒DNA的装载效率分别达94.89%和91.98%,装载红色荧光蛋白质粒pDSred-N1的DH5α菌蜕转染巨噬细胞RAW264.7,红色荧光蛋白的表达效率可达50%。结论大肠杆菌DH5α菌蜕可以用于装载核酸疫苗并将其靶向性地导入到抗原递呈细胞中,可获得较高的表达效率,初步验证了大肠杆菌DH5α菌蜕作为核酸疫苗载体的可行性。     

大肠杆菌表达的rhTNFα D11a中试发酵工艺研究

初步研究了以可溶形式在大肠杆菌中表达的重组人肿瘤坏死因子α（ｒｈＴＮＦα）衍生物１１ａ中试水平的发酵工艺，包括工程菌（ＤＨ５α／ｐＢＶＴＮＦΔ）密度、诱导时间及宿主菌对菌体收得率、目的蛋白表达量及其比活性的影响，建立了较稳定的中试发酵方法，以此条件５０Ｌ罐发酵的工程菌，１００００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ菌体收得量可达湿重１４ｇ／Ｌ培养物；目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的３１％；比活性约为１×１０８Ｕ／ｍｇ蛋白。     

G-CSF-pJGW1/pGP1-2/DH5α工程菌的系统稳定性研究

将构建好的rhG-CSF工程菌(G-CSF-PJGWI/pCP1-2/DH5a)由-70℃冰箱取出,连续培养140代,每20代观察工程菌质粒的遗传稳定性及rhG-CSF工程菌蛋白表达稳定性。结果表明:rhG-CSF工程菌在连续培养140代后,其抗生素抗性无改变,质粒DNA酶切鉴定与原始菌相同,其蛋白表达率与原始菌基本一致。     

幽门螺杆菌HpaA减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗的构建及免疫原性检测

目的 构建含幽门螺杆菌(H．pylori)hpaA基因的重组减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗。方法 应用PCR方法从H．pylori标准菌株基因组DNA中扩增hpaA基因,克隆入pUCmT载体,检测hpaA基因序列,经过酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pIRES,转入大肠杆菌,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应鉴定。重组载体pIRESrhpaA转化入减毒鼠伤寒沙门菌LBS000,抽提质粒,再转化入SL7207,反复传代,鉴定重组核酸疫苗菌的稳定性。重组载体pIRES-hpaA通过脂质体法转染CCXS-7细胞,SDS-PAGE及Western印迹法检测pIRES-hpaA表达HpaA蛋白的免疫原性。结果 成功扩增出长约750bp的hpaA基因,测序结果表明扩增出的hpaA基因与H．pylorihpaA序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实hpaA基因克隆入真核表达载体pIRES,成功构建了含hpaA基因的幽门螺杆菌核酸疫苗pIRES-hpaA,并成功构建了幽门螺杆菌hpaA基因的减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,重组核酸疫苗稳定,Western印迹法检测到了特异性的蛋白条带。结论 构建了具有免疫反应性的H．pylori hpaA减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,为进一步探索其免疫作用奠定了基础。     

大肠杆菌细菌菌蜕的制备及初步研究

目的:利用温度控制噬菌体PhiX174裂解基因E的表达,制备大肠杆菌细菌菌蜕,鉴定其裂解效率并观察其形态.方法:利用PCR技术扩增分离了噬菌体PhiX174裂解基因E并构建其表达质粒,并将质粒转化大肠杆菌DH5α构建工程菌.工程菌培养温度从28℃突升至42℃,每15 min检测菌液D600值,诱导后4 h收集菌体.体外菌落计数计算裂解效率,并通过电镜观察菌蜕结构.结果:获得273 bp的PhiX174裂解基因E全长基因及表达质粒.菌液D600在温度突升至42℃后30 min开始持续下降,2 h后基本维持不变.4 h后收集菌体测得裂解效率为99.99%.电镜观察菌蜕为具有完整外膜结构的细菌空壳,并且无细胞毒性.结论:本研究成功利用噬菌体PhiX174裂解基因E实现了大肠杆菌细菌菌蜕的制备,为进一步的疫苗及递送系统研究奠定了基础.     

重组人干细胞因子工程菌的培养研究

目的：对工程菌DH5a(pMG604)的批次补料培养和连续补料培养工艺进行研究。方法：通过摇瓶试验筛选适合重组人干细胞因子工程菌DHSa(pMG604)生长和产物表达的基础培养基，在此基础上进行了分批补料批培养和连续补料批培养的研究。结果：30L发酵罐分批补料批培养，菌密度为11．9(D600)，rhSCF表达水平为42％。5L发酵罐连续补料批培养，最终菌密度为148(D600)，rhSCF表达水平为31％。     

中国流行的C基因型HBV稳定复制表达细胞系的建立

目的 建立中国流行的C基因型HBV的稳定复制表达细胞系.方法 从1例慢性乙肝患者血清中分离克隆得到1株C基因型病毒DNA全序列,以此为模板扩增产生1.3倍体HBV DNA,包含完整基因组(3.2kb)、从1825位点(polyA)至2599位点大小为775bp的3′端冗余序列,以及至1400位点大小为425bp的5′端冗余序列,将其连接改建重组后的pcDNA3.1(+)载体,构建pN31-51-6-1表达质粒,转染肝癌细胞系HepG2.采用ELISA检测HBsAg、HBeAg的瞬时表达情况,选择双高表达细胞孔进一步行G418筛选稳定表达细胞系.通过ELISA、免疫组化、直接免疫荧光流式细胞术以及HBV复制中间体核心颗粒DNA、细胞内cccDNA、分泌上清中病毒DNA的RT-PCR检测等方法评估稳定细胞克隆的复制表达情况.结果 获得1株具有高抗原表达和高复制能力的细胞克隆HepG2-51-6-1,已稳定传代26代.检测HBsAg、HBeAg吸光度(A)值分别为>3.5和1.29;直接免疫荧光流式细胞术证实细胞表面存在s抗原,免疫组化染色可见细胞内病毒表达.分泌到培养上清中的HBV DNA和细胞内的HBV复制中间体水平分别为2.0×104和5.5×105拷贝/ml,HBV cccDNA为6～8拷贝/细胞.结论 成功获得HBV-1.3倍体转染的C基因型HBV稳定复制表达细胞系,为研究我国流行HBV的生物特性和抗HBV新药筛选奠定了基础.     

产肠毒素性大肠杆菌的研究进展

致病性大肠杆菌的毒力因子主要有黏附素、毒素、EatA等。在大肠杆菌侵袭宿主组织并引起其发病的过程中,这些毒力因子相互协调、发挥作用。文章对毒力因子的致病作用、致病机理、免疫原性及其在疾病防制中的应用几个方面的研究概况作了综述,为防制大肠杆菌病、研制新型高效的大肠杆菌疫苗提供了理论依据。另外,文章还介绍了近年来已相继研制成功的全菌体疫苗、单价或多价基因工程菌毛疫苗以及重组肠毒素双价基因工程苗等。展现了新型疫苗的研制,给防制大肠杆菌病带来了新的前景以及大肠杆菌作为工程菌的应用对畜禽其他疾病防制的推动作用     

新疆奎屯地区高砷环境中抗砷菌的初步筛选

目的初步筛选新疆奎屯地区高砷环境中（123团4连）自流井水和污水中存在的高抗砷菌,检测其抗砷能力。方法选择高砷自流井水和污水标本,在NaAsO2选择性培养基上,分离和纯化,筛选出抗砷菌,初步进行细胞形态学的鉴定;用不同NaAsO2浓度的LB培养基对菌株抗砷性进行检测,测定其抗砷水平。结果初步筛选出5株抗砷能力较强的抗砷菌。A1、A2、A3均为革兰氏阴性杆菌。B1、B2均为革兰氏阳性球菌;5株菌均可在含有NaAsO2（50．400mg／L）培养基中生长。最高耐受到400mg／L,是新疆奎屯高砷水含量实际最高值的517倍,最低值的1156倍。结论①经初步筛选,确认新疆奎屯地区高砷环境中的自流井水和污水中存在高抗砷菌,首次成功筛选出5株强抗砷菌。②A1菌株的抗砷能力最强,可在400mg／LNaAsO2的LBA培养基上生长。本研究为新疆地区抗砷菌的深入研究提供了基础资料。     

M13φX174RFDNA及其HaeⅢ片段的制备

M13及φX174噬菌体均为单链DNA噬菌体。在大肠杆菌繁殖时有一个合成双链的复制型DNA(Replicative form DNA,简称RFDNA)的阶段,然后以滚环方式合成单链DNA,再组装成含单链DNA的成熟噬菌体释放到菌体外。在DNA重组研究中,常用它们的复制型DNA经特定的限制性内切酶酶介(如HaeⅢ),获得特定的已知分子量的线状DNA片段,作为测定未知分子量DNA片段的标准物。国外RFDNA的提取主要应用氯化铯密度梯度超离心的方法。国内关于M13及φX174噬菌体的培养及其DNA的提取尚未见有报导。考虑到国内超速     

分枝杆菌噬菌体D29裂解酶基因的表达与鉴定

目的：在耻垢分枝杆菌中表达预测的噬菌体D29裂解酶基因片段,鉴定其细胞壁裂解活性。方法：在分析分枝杆菌噬菌体D29开放阅读框序列的基础上,用PCR法从噬菌体D29基因组DNA中扩增出与裂解酶同源性较高的序列gene10,将其克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒后,在耻垢分枝杆菌中进行诱导表达。对表达产物进行SDS-PAGE检测,对诱导培养重组菌进行混浊度测定、透射电镜观察以鉴定其裂解活性。结果及结论：成功构建了重组穿梭质粒pUV-gene10并使gene10在耻垢分枝杆菌中获得表达,表达产物能有效降低宿主菌培养液混浊度,降解宿主菌细胞壁,证实gene10表达产物为噬菌体裂解酶,并推测其为非经典分泌蛋白。     

登革2型病毒NS5蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

目的 :构建登革 2型病毒 (DEN_2 )NS5表达体系 ,摸索适宜的诱导表达条件 ,克服大分子蛋白难以表达的瓶颈 ,获得DEN2_2NS5 (相对分子质量 10 4× 10 3)表达产物 ,为以后对其活性、抑制剂等方面的研究奠定基础。方法 :自DEN_2感染组织提取总RNA ,RT_PCR扩增NS5基因片段 (2 .7kb) ,插入质粒pQE30 ,转化XL1Blue大肠杆菌得表达菌株XL1Blue QENS5。同时优化诱导表达和目的蛋白的纯化条件。结果 :表达菌株XL1Blue QENS5增菌培养后更换新的培养基 ,在一定温度范围条件下诱导可以表达出最高占菌体总蛋白 2 2 .8%的NS5蛋白 ,在较低温度下诱导目的蛋白能以可溶性形式表达 ,经过纯化后的NS5蛋白纯度可达 90 %以上。结论 :在国内首次实现了DEN_2NS5蛋白的表达 ,获得的诱导表达条件可能对于其他大分子蛋白的表达有一定的借鉴意义。     

质粒介导的耐多药大肠埃希菌CTX-M、CTX-M-3基因检测

目的了解泸州本地质粒介导的耐多药大肠埃希菌的CTX M、CTX M 3基因分布情况。方法用K-B法进行耐药菌株筛选,PCR扩增CTX M、CTX M 3基因,琼脂糖凝胶电泳检测基因大小,阳性产物外送测碱基序列。结果 71株大肠埃希菌中,有一株死亡。全敏6株,占8.57%,单耐16株,占22.86%,双耐18株,占26.71%,耐多药30株,占42.86%。耐多药质粒中的阳性结果经DNA测序仪检测基因序列,与已知的基因相比较,CTX M有23株,占76.67%,CTX M 3有21株,占70%。两种基因均含有的有12株,占40%。结论泸州地区耐多药大肠埃希菌存在质粒介导的CTX M、CTX M 3基因,耐多药的大肠埃希菌对第三代头孢菌素中的头孢唑肟敏感,对亚胺培南,美罗培南较敏感。     

HBV(ayw)转基因小鼠HBV复制中间体的检测

目的建立稳定、高灵敏度化学发光Southern blotting检测系统,检测HBV(ayw)转基因小鼠肝脏及其他组织的HBV复制水平。方法采用地高辛标记HBV探针,利用pTHBV1047质粒检测杂交系统的灵敏度及重复性;提取第27代HBV(ayw)转基因小鼠肝、肾、脾和肌肉组织总DNA,经HindⅢ酶切后电泳、转膜,利用高灵敏度化学发光杂交Southern blotting检测各组织中HBV复制中间体的水平。结果地高辛标记的化学发光检测系统灵敏度达0.1pg,且杂交系统稳定可靠。HBV(ayw)转基因小鼠基因组DNA中检测到整合的外源HBV DNA,但低于HepG2.2.15细胞的HBV复制水平。肝、肾、脾和肌肉组织中都有HBV复制中间体存在,以肝组织中含量最高。结论第27代HBV(ayw)转基因小鼠染色体含有稳定的HBV基因整合,为复制型HBV转基因小鼠。     

纳米二氧化钛对多药耐药质粒RP4接合转移的影响

目的探讨纳米TiO2对多药耐药质粒RP4接合转移的影响及规律。方法供体菌为Escherichia coli HB101(RP4),受体菌为具有耐利福平的E.coli K12Rif,保持供、受体菌液浓度比例为1∶1,在一定条件下静止接合一定时间后,利用含有不同抗生素的LB琼脂培养基选择平板计数接合子数量并计算接合转移频率。结果纳米TiO2可促进RP4的接合转移,该促进作用与纳米TiO2浓度、接合菌液密度、接合温度以及接合时间有关,与接合体系pH值无关。结论在一定条件下,纳米TiO2可促进质粒的接合转移,从而加重抗生素耐药的问题。     

红色糖多孢菌表达载体pZW的构建

目的:对红色糖多孢菌染色体整合型表达载体pZMW进行改进,以提高表达载体稳定性和表达外源基因效率.方法:以pSET152和pET-22b( )为出发质粒,用PCR方法从红色糖多孢菌染色体DNA上扩增红霉素抗性基因启动子PermE作为表达载体启动子,并利用pSET152质粒上链霉菌染色体整合位点(attP)和安普霉素抗性基因,构建了红色糖多孢菌表达载体pZW.结果:与pZMW相比,pZW表达载体只有1个大肠杆菌质粒复制子,质粒减小2 530 bp,同时在链霉菌属细菌和红色糖多孢菌中能够表达硫链丝菌肽抗性基因(thio)和荧光蛋白基因(EGFP).结论:pZW质粒能够在链霉菌属细菌和红色糖多孢菌中稳定表达外源基因.     

人源抗HBsAg Fab工程化大肠杆菌优化表达的实验研究

目的：探讨表达人源抗HBsAg Fab工程化大肠杆菌的优化培养模式及诱导方法，以期大量获取人源抗HBsAg Fab。方法：在摇瓶发酵条件下探讨工程菌的生长和表达规律，筛选最佳的培养模式及诱导表达条件，后于发酵罐中行补料高密度发酵试验，以确定最佳补料模式。结果：由摇瓶发酵获得的数据表明，当培养体系处于对数生长中期为诱导表达的起点，在250℃下以O．2％arabinose诱导12h条件下Fab的产率最佳，采用溶氧控制补料模式可使培养体系的最大OD600达到55．2，相当于湿菌含量110g/L水平。同时，经证实Fab的抗原结合活性良好。结论：确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺，为应用原核表达体系工业化大批量生产基因工程抗体奠定了基础。     

慢性乙型肝炎患者血清HBV全长序列分析及复制力评价

目的 分析乙型肝炎患者HBV全长基因组序列并对其复制力进行评价.方法 从慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV病毒DNA,PCR扩增HBV全长基因组,克隆到pGEM-Teasy载体中,每个样品挑选5～10个克隆测序,分析基因型以及全长基因组耐药相关的突变位点,并对个别位点进行定点突变.将克隆到pGEM-Teasy载体中的全长HBV基因组经BspQ Ⅰ/Sca Ⅰ双酶切后,转染入肝癌细胞系HepG2、Huh7.转染3d后榆测上清HmAg表达量及细胞内HBV复制中间体核心颗粒DNA载量,分析全长HBV基因组的复制力(1.0倍HBV复制模型).结果 从2份慢性乙型肝炎患者血清中成功获得5条HBV全长克隆,来自同一份血清的克隆核苷酸,其一致性为98%～100%,提示HBV存在准种特性.测序结果 表明5条HBV全长基因均为C型.通过定点突变又获得3个全长克隆.经序列分析发现,HBV反转录酶区存在A181V/S、L229M、V84M、M204I氨基酸位点的突变,前C/C区存在T1753C、A1762T、G1764A和G1896A核苷酸位点的突变.复制力分析提示上述位点突变后病毒复制力均有不同程度下降,L229M还可以进一步降低A181V突变株的复制力.结论 自行建立的无载体1.0倍HBV复制模型可在细胞内分泌抗原蛋白以及装配子代病毒,完成生活周期,这为下一步分析HBV的耐药表型打下了基础.此外,还可指导临床制定更加合理的抗病毒策略,筛选针对已出现或将来可能出现的耐药突变的新型抗病毒药物.