乙肝治疗性可复制型DNA疫苗pSVK-HBVA高稳定宿主菌的筛选及其基础培养基的选择

目的为乙肝治疗性可复制型DNA疫苗质粒pSVK-HBVA筛选稳定性高,能多次传代的宿主菌,以满足中试工艺的要求,同时对该工程菌最适的基础发酵培养基进行选择。方法将质粒pSVK-HBVA分别转化几种不同的大肠杆菌感受态细胞并提取质粒,通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒的形态结构,连续传代法对工程菌的稳定性进行检测;选取质粒含量最高和稳定性最好的工程菌作为原始种子,按照2010版《中国药典》要求建立工程菌的三级种子批,并对种子批进行鉴定。同时,从LB,TB,M9(甘油),M9(葡萄糖)4种培养基中为工程菌筛选质粒产量最高的基础发酵培养基。结果经过筛选发现,在以大肠杆菌XL10-Gold为宿主菌时,质粒pSVK-HBVA表现出了同常规质粒DNA类似的稳定性,转接传代30次也未发生重组或片段丢失,能满足后续中试工艺的要求,LB作为基础培养基能得到最高的质粒容积产率为5.5 mg/L。结论大肠杆菌XL10-Gold是一个更利于可复制型DNA疫苗质粒pSVK-HBVA扩增的宿主菌,该工程菌发酵的最佳基础培养基是LB培养基。     

乳糖诱导重组人甲状旁腺素（1-34）高密度发酵研究

利用乳糖诱导工程菌pET(32a+)-PTH(1-34)/BL21(DE3) 高效表达人甲状旁腺激素1-34融合蛋白.并对乳糖浓度、诱导温度、诱导时机等参数进行优化,得到目的蛋白高表达乳糖诱导高密度发酵工艺.三批实验结果表明,人甲状旁腺激素1-34融合蛋白表达量在33%左右,工程菌生物量在55 g/L左右.     

人胰岛素样生长因子-1真核表达质粒的构建及其在成肌细胞中的表达

目的 :构建人胰岛素样生长因子 - 1(hIGF - 1)真核表达质粒pcDNA3.1(- ) /hIGF - 1并通过转染成肌细胞来验证其生物活性。方法 :应用DNA重组方法将编码hIGF - 1cDNA克隆于真核表达载体pcDNA3.1(- )中 ,构建pcDNA3.1(- ) /hIGF - 1真核表达质粒 ;应用阳性脂质体介导的基因转染技术 ,将真核表达质粒pcDNA3.1(- ) /hIGF - 1瞬时转染C2C12成肌细胞中 ;采用RT -PCR及免疫组化染色等方法检测hIGF - 1基因在成肌细胞中的表达情况 ;应用MTT法检测转染后细胞上清液中hIGF - 1的生物活性。结果 :将构建好的真核表达质粒pcDNA3.1(- ) /hIGF - 1转染成肌细胞后 ,hIGF - 1mRNA及蛋白表达水平明显增高 ;转染后的成肌细胞培养上清液具有促使成纤维细胞增殖的生物活性。结论 :成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(- ) /hIGF - 1,其转染成肌细胞后可获得较高水平hIGF - 1蛋白的表达 ,所表达出hIGF - 1蛋白具有生物学活性。     

半乳糖凝集素-1的表达纯化与生物活性分析

目的：获得重组人半乳糖凝集素-1（galectin-1）蛋白,并分析其生物学活性。方法：PCR方法扩增目的基因,将其克隆到原核表达载体pET21a（＋）,获得重组质粒pET-galectin;将其转化至表达宿主菌BL21（DE3）中,用IPTG进行诱导,获得目的蛋白的表达;采用Ni-NTA亲和层析柱对目的蛋白进行纯化,用红细胞凝集试验分析其生物学活性。结果与结论：成功构建重组原核表达质粒pET-galectin,目的蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,经Ni-NTA亲和层析柱一步纯化后,得到的蛋白纯度可达80%以上。红细胞凝集试验结果表明获得的重组蛋白具有较好的生物学活性,可进一步用于半乳糖凝集素-1功能研究。     

单极纺锤体蛋白激酶1(Mps1)对蛋白酶体α7亚基(PSMA7)蛋白稳定性的影响

目的 研究单极纺锤体蛋白激酶1(Mps1)对蛋白酶体α7亚基(PSMA7)蛋白稳定性的影响.方法 通过重组PCR方法将663位天冬氨酸突变为丙氨酸,构建Mps1激酶活性缺失的突变体(pcDNA3-Flag-Mps1 KD),并通过免疫印迹实验检测其是否能成功表达.采用免疫印迹实验检测Mps1及Mps1KD对PSMA7蛋白稳定性的影响;通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测Mps1及Mps1 KD对PSMA7 RNA表达水平的影响.结果 免疫印迹结果证实构建的突变质粒Mps1 KD能正确表达且野生型Mps1可明显增强PSMA7稳定性,而Mps 1KD则不能;加入Mps1激酶活性抑制剂后,降低PSMA7稳定性;RT-PCR检测结果发现Mps1及Mps1 KD对PSMA7RNA表达水平无影响.结论 成功构建了Mps1激酶活性缺失突变体真核表达质粒pcDNA3-Flag-Mps1 KD,并在293T细胞中得到了表达;研究还发现Mps1通过其激酶活性可增强PSMA7蛋白稳定性,但对其RNA表达水平无影响,为进一步研究Mps1对蛋白酶体功能影响及对肿瘤发生发展奠定基础.     

鼠疫耶尔森菌201株和201△pCD1株蛋白表达谱比较研究

目的：分析缺失编码Ⅲ型分泌系统的大质粒pCD1对鼠疫耶尔森菌蛋白质表达谱的影响,探索鼠疫菌的潜在致病机制,为鼠疫疫苗研制提供新线索。方法通过双向电泳与质谱分析相结合的方法,比较鼠疫菌在26℃和37℃不同培养温度下,全菌蛋白表达谱差异,鉴定差异蛋白并对其功能进行初步分析。结果成功分离并鉴定了鼠疫菌201株和201△pCD1缺失突变株中的差异蛋白,其中26℃条件下鉴定到24个差异蛋白,37℃条件下鉴定到25个差异蛋白,内含7个由pCD1质粒编码的蛋白。结论通过比较蛋白质组学研究,发现大质粒pCD1缺失后,多种染色体编码蛋白的丰度发生了显著变化,暗示大质粒能调控染色体编码基因的表达。     

不同培养基和寄主菌对白介素—Ⅱ工程菌表达的影响

本文比较了LB、M9CA 两种培养基和大肠杆菌 DH5α和 RRl 寄主菌,对白介素-Ⅱ(IL-Ⅱ)工程菌表达的影响。比较结果表明,M()CA培养基和DH5α寄主菌效果较好,其表达 IL-Ⅱ的蛋白量占整个菌体蛋白量的18%,占包涵体蛋白量的53%。     

重组脂联素融合蛋白的表达及其生物学活性测定

目的表达重组脂联素融合蛋白（adiponectin-Trx）,并测定其生物学活性。方法从小鼠脂肪组织提取总RNA,应用序列特异性引物经RT-PCR方法扩增获得全长脂联素基因序列,克隆至pGEM-T载体,序列经DNA测序证实。将目的序列（18-247氨基酸）亚克隆至pET-32（a）表达载体,重组质粒adiponectin/pET32（a）的序列经测序证实。将adiponectin/pET32（a）转化表达宿主菌OrigamiTM（DE3）,在27℃以1mmol/L IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE和氨基酸测序检测目的蛋白的表达,目的蛋白经组氨酸镍螯和树脂亲和纯化。以不同浓度的融合蛋白adiponectin-Trx和Trx蛋白处理体外培养的人脐静脉内皮细胞,细胞增殖法测定其生物学活性。结果小鼠脂肪组织脂联素基因的编码序列,337位点上的碱基A被G置换,导致在113位的蛋氨酸被缬氨酸取代。序列测定表明,构建的重组表达载体adiponectin/pET32a序列完全正确,诱导工程菌主要表达可溶性的融合蛋白adiponectin-Trx,部分以包含体形式表达。表达产物的相对分子量（Mr）同预期分子量相同,adiponectin-Trx Mr为43000,Trx Mr为19000。在低浓度时融合蛋白刺激人脐静脉内皮细胞增殖。结论小鼠脂肪组织脂联素基因编码序列与来自3T3-L1脂肪细胞的编码序列不同。成功地在E.coli中表达了重组脂联素融合蛋白并具有生物学活性。     

miR-9对神经纤毛蛋白-1的靶向调控及其在辐射效应中的作用

目的：构建has-miR-9表达质粒和NRP1-3’UTR荧光素酶报告质粒,探讨miR-9对 NRP1的靶向调控作用及其在A549 细胞中的辐射效应。方法：利用生物信息学方法预测has-miR-9与NRP1-3’UTR的结合位点;将miR-9序列插入载体pcDNA-DEST47中构建真核表达质粒,同时构建NRP1-3’UTR的野生型和突变型荧光素酶报告质粒,并与pcDNA-DEST-miR-9质粒共转染至A549细胞,分析miR-9对其调控作用;miR-29b作为阴性对照,观察miR-9对NRP1的靶向作用。采用Western blot方法,验证miR-9对NRP1蛋白表达的抑制作用及照射后A549细胞NRP1蛋白表达变化;采用实时定量PCR方法检测10 Gy电离辐射照射后A549细胞miR-9表达量。结果：荧光素酶活性实验结果显示,miR-9可以显著下调野生型NRP1-3’UTR质粒的荧光素酶活性（t=3.906,P<0.05）,而不影响突变型质粒的荧光素酶活性,同时证实miR-9以外的miRNA（miR-29b）不能抑制野生型NRP1-3’UTR质粒的荧光素酶活性。转染miR-9 mimic后,在A549细胞中,靶基因NRP1蛋白的表达受抑制。10 Gy照射后,A549细胞中miR-9表达量下调（t=37.319,P<0.05）,而NRP1蛋白表达升高。结论：在A549辐射效应中miR-9通过靶向结合NRP1基因3’UTR,特异性调控NRP1蛋白表达。     

抗辐射球菌辐射抗性机制的研究

抗辐射球菌是一种对电离辐射和其他DNA损伤因子有极强抵抗能力的细菌。对它的研究主要集中在揭示其对DNA损伤的抗性机制和如何利用它清除辐射废料。现有研究认为,该菌的抗性机制主要缘于三个方面:(1)DNA损伤的高效修复;(2)特殊的生存方式;(3)对氧自由基的有效清除。     

重组人甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶的表达纯化和鉴定

目的对重组人甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶（recombinant human betaine-homocysteine S-methyltrans-ferase,rhBHMT）进行表达纯化和鉴定。方法采用基因重组技术在原核系统表达BHMT蛋白,镍螯合亲和层析和Sephacryl S200层析进行纯化。产物经SDS-PAGE、HPLC、N端氨基酸序列检测与活性验证。结果终产物rhBHMT纯度达97.9%。相对分子质量为45 000,N端氨基酸序列与理论序列一致。结论从工程菌中获得具有活性的高纯度rhBHMT,产物均一,工艺稳定,为中试放大提供可靠依据。     

萨湖杂交后代母羊非繁殖季节同期发情配种效果分析

本试验是在新品种培育基础上,为了缩短时代间隔,加快育种进程,利用萨福克肉羊和湖羊的杂交后代(F1、F2代),其中F2代为3/4萨福克血,进行了春季非繁殖季节的同期发情试验.其中非繁殖季节4月同期处理杂一代母羊107只,有发情表现105只,同期率97.23%,配种受胎率83.3%,第一情期受胎率(73/108),67.59%,秋季产羔89胎,产羔羊144只,产羔率161.64%,杂二代母羊第一情期受胎率(72/31),44.93%,秋季产羔29胎,产羔羊37只,产羔率127.59%.     

重组人抗-HBs单链抗体与白细胞介素2融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定

目的 探讨抗-HBs单链抗体与白细胞介素2融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定方法。方法 将构建的目的蛋白表达工程菌M15[pQE-ScFv-IL-2]经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE及Western blot分析鉴定表达产物;再通过Ni^2 离子金属螯合亲和层析和离子交换层析纯化目的蛋白;采用逐步透析法对纯化后的目的蛋白进行复性后,用间接ELISA实验和CTL-2细胞增殖反应实验对其进行活性鉴定。结果 SDS-PAGE及Western blot分析结果显示有分子量约为43kD的重组蛋白表达,表达量可达18％;两步纯化后凝胶成像分析目的蛋白的纯度达到95％;复性后纯化产物的活性鉴定结果表明,重组抗体融合蛋白既能与HBsAg特异性结合,也能刺激CTLL-2细胞增殖。结论 获得的抗体融合蛋白兼具亲本分子的双特异性,为慢性乙型肝炎及相关疾病的导向治疗研究打下了良好基础。     

Morphological and chromosomal abnormalities in gamma radiation-induced mutagenized faba bean genotypes

Purpose: This study was conducted to evaluate and compare the influence of gamma radiations on morphological and chromosomal abnormalities in twenty mutagenized faba bean populations, representing first and second generations (M₁ and M₂) of five faba bean genotypes.

Materials and methods: Five faba bean genotypes were exposed at two doses of gamma radiations (25 and 50?Gy). For determining the types of chromosomal aberrations caused by the gamma radiation, mitotic and meiotic cells were isolated from root tips and pollen mother cells, respectively.

Results: The M₁ generations of the five genotypes varied for sensitivity to gamma radiations, for seedling emergence. The genotype Skah 2 was more sensitive than other genotypes, the order of sensitivity of other genotypes was Misr 3?>?ILB 4347?>?Hassawi 2?>?Hassawi 3. However, seedling emergence of the M₂ generations was not as much reduced as that of the M₁ generations. Ten different chlorophyll-deficient mutants were identified among the M₂ generations. Gamma radiations also caused the development of abnormal leaflets, flowers and pollen grains. The most common types of chromosome aberrations in the mitotic cells were stickiness, laggard and chromosome breaks, whereas the most common types in the meiotic cells were stickiness and disturbed polarity.

Conclusion: The gamma radiation decreased the seedling emergence and induced a wide range of morphological and chromosomal abnormalities in faba bean.     

不同杂交组合与世代5月龄羔羊肉品质分析

对3杂交组合的2个级进世代和2个纯种对照的24只5月龄羔羊胴体的72个样品的48项常规成分、微量元素、维生素、物性指标、风味物质和氨基酸的分析结果表明,综合改进效果为DX组合为优、SA组合居中、DA组合第三。     

人尿激酶原工程细胞株CL—11G细胞外源因子的检测

目的：对工程细胞株的要求之一是不应被外源因子污染。因此有必要对表达人尿激酶原的工程细胞株ＣＬ－１１Ｇ进行外源因子的检测。方法：用普通肉汤,改良马丁和硫乙醇酸盐三种培养基对ＣＬ－１１Ｇ细胞进行培养,检查细菌和霉菌;用培养法;ＤＮＡ荧光染色法,单克隆抗体免疫荧光法及电镜检查支原体。用ＣＬ－１１Ｇ细胞悬液分别接种乳小鼠,成年小鼠,豚鼠,家兔,鸡胚及５种细胞,检查有无内外源性病毒污染。结果：ＣＬ－１１Ｇ细     

两种一次性医用防护口罩的临床细菌学评价

目的了解佩戴时间对一次性医用防护口罩防护功能的影响。方法将采集的标本用琼脂培养法作细菌培养对结果进行分析。结果(1)随着佩戴时间的延长,口罩内、外层的细菌总数均增多,且口罩内层细菌数越多,外层的细菌数也相应增加;(2)随着佩戴时间的延长,滤菌率逐渐降低。两种口罩在2 h内,滤菌率均在95%以上,符合国家对一次性口罩滤菌率的要求。结论一次性医用防护口罩的最佳使用时间是2 h。     

海洋细菌增菌培养方法的研究

目的 探讨理想的海洋细菌增菌培养方法.方法 选择不同种类的增菌培养液对海水中细菌进行增菌培养.结果 碱性蛋白胨水与嗜盐菌增菌液对海水弧菌具有良好的增菌效果,2号营养肉汤适合海水普通细菌的增菌培养,液体沙保氏增菌液能从海水中增菌培养出真菌.结论 海水中弧菌增菌应选用碱性蛋白胨水与嗜盐菌增菌液,增菌普通细菌应选用2号营养肉汤,真菌应选用液体沙保氏增菌液.