何首乌与制何首乌对人尿源性干细胞的作用差异及机制研究

目的以人尿源性干细胞(human urine-derived stem cells,hUSCs)为研究对象,探究何首乌(Polygoni Multiflori Radix,PMR)与制何首乌(Polygoni Multiflori Radix Praeparata,PMRP)对人成体干细胞的作用差异及机制。方法利用高效液相色谱法对何首乌水提物(PMR)与制何首乌水提物(PMRP)中主要活性成分大黄素(emodin,EM)和二苯乙烯苷(2,3,5,4’-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glycoside,TSG)进行定量分析;MTT法研究PMR及PMRP对hUSCs活力的影响;根据EM和TSG在2种水提物中的含量和比例,比较单成分及2种成分按比例联用对hUSCs活力的影响;流式细胞术检测hUSCs细胞周期和细胞凋亡,Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达。结果PMR中TSG和EM的含量分别为77.68、0.53 mg/g,PMRP中TSG和EM的含量分别为29.37、0.36 mg/g;0.5、1.0 mg/mL浓度的PMR对细胞有明显毒性,相同剂量下,PMRP促进细胞增殖;0.5~4μmol/L EM促细胞增殖,320、640μmol/L TSG抑制细胞活力;按1∶160(约为PMR比例)和1∶80(约为PMRP比例)联用后对细胞活力的抑制作用较单用显著增加;PMR组及1∶160联用组细胞周期出现G0/G1期阻滞,且细胞凋亡率较PMRP组及1∶80联用组高;Western blot结果显示,PMR组中细胞p21水平上调;CDK1、CDK2及Rb磷酸化水平降低,而PMRP组呈相反趋势。结论相同条件下,PMR较PMRP表现明显细胞毒作用,而PMRP表现促细胞活力作用,说明EM与TSG比例的改变可能是何首乌炮制减毒的机制之一。     

基于细胞色素氧化酶CYP2D6的何首乌肝细胞毒性及相关成分研究

目的探究何首乌及其主要成分对人肝细胞L02中细胞色素氧化酶CYP2D6 mRNA表达的影响以及抑制CYP2D6活性或表达对何首乌肝细胞毒性的影响及相关成分辨识。方法利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)确定何首乌水提物(Polygoni Multiflori Radix,PMR)及其主要成分对L02细胞CYP2D6 mRNA表达的影响;使用CYP2D6抑制剂奎尼丁初步探究PMR对CYP2D6低活性L02细胞系的细胞毒作用;构建CYP2D6沉默的L02细胞系L02-shCYP2D6,进一步研究L02细胞中CYP2D6表达降低对PMR及其主要成分肝细胞毒性的影响;可能的肝细胞毒性成分与人肝微粒体进行体外孵育,通过考察加入不同CYP450酶特异性抑制剂对其代谢消除率的影响,探究影响其代谢的主要CYP450酶。结果在实验浓度下,PMR和芦荟大黄素(AE)对CYP2D6 mRNA表达有显著抑制作用(P<0.01),大黄素(EM)无明显影响,2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(TSG)仅在高浓度有一定激活作用,其余浓度无影响;PMR联合奎尼丁作用于L02细胞,发现PMR在高浓度下对L02细胞有一定毒性(P<0.01),各浓度抑制剂与之联用后均明显加重了其肝细胞毒性(P<0.01);PMR及其主要成分作用于CYP2D6敲低的L02细胞系,除TSG在高浓度下提升了肝细胞毒性外(P<0.01),PMR、EM、AE在实验浓度范围内肝细胞毒性均显著增加(P<0.01);人肝微粒体体外孵育实验显示,CYP2D6为EM、AE重要的代谢酶。结论PMR能够抑制肝细胞中CYP2D6的表达,而CYP2D6的低活性或低表达能够加重PMR肝细胞毒性,其中主要的毒性成分为EM和AE。     

脱水淫羊藿素维持人尿源性干细胞干性的作用研究

目的:探究脱水淫羊藿素(DICT)对人尿源性干细胞(hUSCs)干性的影响。方法:常温离心法体外分离培养hUSCs,倒置相差显微镜下进行hUSCs形态学观察;根据MTT实验绘制hUSCs接种后1~7 d的生长曲线;流式细胞术检测hUSCs表面标志物;分别设hUSCs培养基对照组,浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μmol/L的DICT处理组,利用四甲基噻唑蓝(MTT)实验检测作用1~7 d后各组的细胞活力;采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测2.0μmol/L DICT作用hUSCs 3 d后,对干性基因OCT-4、C-MYC mRNA表达的影响。结果:通过常温离心法成功获得形态良好、生长活性较高的hUSCs,hUSCs表达间充质干细胞表面标志物CD44和CD90,不表达造血干细胞表面标志物CD34和内皮细胞表面标志物CD31。2.0μmol/L DICT作用3~6 d能显著促进hUSCs的增殖,增强其生长活力(P<0.01),上调hUSCs干性基因OCT-4、C-MYC的mRNA表达(P<0.01)。结论:DICT在体外可增强hUSCs的干性。     

何首乌、虎杖、大黄水提物中游离蒽醌含量的测定及对人正常肝细胞的毒性作用

目的:测定何首乌、虎杖、大黄3种中药水提物中游离蒽醌含量,比较3种中药水提物对人肝祖细胞Hepa RG的体外细胞毒作用,探讨何首乌、虎杖、大黄中游离蒽醌含量与肝细胞毒性的关系。方法:煎煮法制备何首乌、虎杖、大黄3种受试饮片水提物,采用高效液相色谱色谱法分别同步测定3种水提物中5种主要游离蒽醌大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚的含量;分别以浓度为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/m L的3种中药水提物溶液处理Hepa RG细胞48 h后,加入噻唑兰检测其活力;分别以1.5、2.0、2.5 mg/m L的3种中药水提物溶液处理Hepa RG细胞48 h后,AnnexinⅤ/PI双染后流式细胞术检测凋亡细胞比例。结果:何首乌水提物中主要游离蒽醌含量为0.229%,虎杖水提物中为0.545%,大黄水提物中为2.593%;何首乌水提物(2.0、2.5、3.0 mg/m L)、虎杖水提物(1.5、2.0、2.5、3.0 mg/m L)、大黄水提物(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/m L)均可抑制Hepa RG细胞活力,且抑制程度与主要游离蒽醌含量呈正相关;细胞凋亡实验结果表明,3种中药水提物(1.5、2.0、2.5 mg/m L)均明显诱导Hepa RG细胞凋亡,且凋亡率与主要游离蒽醌含量呈正相关。结论:3种中药水提物中主要游离蒽醌含量由低到高依次为何首乌、虎杖、大黄,该含量与其体外肝细胞毒性作用成正相关,提示游离蒽醌可能是3种中药产生肝细胞毒性的重要成分。     

抑制CYP2E1增强何首乌水提物肝毒性作用及其毒性成分筛选研究

目的研究肝细胞色素氧化酶P450(CYP450)亚型CYP2E1与何首乌肝毒性的关系并筛选有关毒性成分。方法MTT法检测CYP2E1特异性抑制剂二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDTC)作用后何首乌水提物(PMR)对人肝细胞L02的毒性作用,及PMR和6种成分2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(2,3,5,4-tetrahydroxy stilbene glycoside,TSG)、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(emodin-8-O-β-D-glucoside,EG)、大黄素(emodin,EM)、没食子酸(gallic acid,GA)、大黄素甲醚(physcione,PH)和大黄酸(rhein,RH)对稳定转染shCYP2E1的HepaRG细胞的毒性作用;利用CYP2E1特异性抑制剂4-甲基吡唑(4-methylpyrazole,4-MP)作用大鼠,进一步验证何首乌对大鼠的肝毒性作用与CYP2E1抑制的关系。结果DDTC处理L02细胞24 h后,CYP2E1活性显著下降(P<0.05),PMR联用DDTC后细胞活力明显下降(与PMR、DDTC组相比,P<0.01);成功构建了HepaRG-shCYP2E1细胞系,与空质粒对照组相比,其CYP2E1 mRNA表达下降70%以上;与对照组相比,何首乌提取物PMR、EM、PH及RH对HepaRG-shCYP2E1的细胞毒作用显著增加(P<0.01),而TSG和EG在一定浓度下细胞毒作用降低(P<0.01);大鼠实验表明,何首乌与CYP2E1抑制剂联合作用于大鼠后,与空白组、抑制剂组相比,ALT及AST的水平均明显升高,与何首乌组相比,AST水平显著升高,说明大鼠体内CYP2E1被抑制后,何首乌的肝毒性作用增强。结论CYP2E1活性或表达下降可导致何首乌水提物肝细胞毒性及大鼠肝毒性增加,其毒性成分可能为游离蒽醌类成分EM,PH及RH。     

CYP1A2低表达增强何首乌水提物及其相关单体成分肝细胞毒性的研究

目的建立CYP1A2低表达人正常肝细胞株,探究何首乌水提物(PMR)及其相关单体成分的肝细胞毒性与CYP1A2低表达的关系。方法运用RNA干扰技术构建稳定转染shCYP1A2的2种人正常肝细胞系L02、HepaRG,RT-qPCR验证干扰效果;PMR及其相关单体成分:二苯乙烯苷(2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG)、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(emodin-8-O-β-D-glucopyranoside,EG)、没食子酸(gallic acid,GA)、大黄素(emodin,EM)、大黄素甲醚(physcion,PH)、芦荟大黄素(aloe-emodin,AE)、大黄酸(rhein,RH)作用CYP1A2敲低的L02及HepaRG细胞48 h,MTT检测细胞活力。结果成功构建了稳定转染shCYP1A2的2种人正常肝细胞系,L02-shCYP1A2、HepaRG-shCYP1A2与相应空质粒对照组相比,CYP1A2 mRNA表达分别下降了59.81%(L02-shCYP1A2)和66.60%(HepaRG-shCYP1A2)。1.5~3 mg/mL PMR作用CYP1A2敲低的L02-shCYP1A2细胞48 h,细胞毒性显著增加(P<0.01);2.5~3 mg/mL PMR作用CYP1A2敲低的HepaRG-shCYP1A2细胞48 h,细胞毒性显著增加(P<0.05、P<0.01);40~120μmol/L GA作用CYP1A2敲低的L02-shCYP1A2及HepaRGshCYP1A2细胞48 h,细胞毒性显著增加(P<0.01、P<0.01);AE作用CYP1A2敲低的HepaRG-shCYP1A2细胞48 h,细胞毒性显著增加(P<0.01)。结论CYP1A2低表达显著增加PMR的肝细胞毒性,推测GA和AE可能为相关的增毒成分。     

何首乌、虎杖、大黄水提物中游离蒽醌含量的测定及对人正常肝细胞的毒性作用

目的：测定何首乌、虎杖、大黄3种中药水提物中游离蒽醌含量，比较3种中药水提物对人肝祖细胞HepaRG的体外细胞毒作用，探讨何首乌、虎杖、大黄中游离蒽醌含量与肝细胞毒性的关系。方法：煎煮法制备何首乌、虎杖、大黄3种受试饮片水提物，采用高效液相色谱色谱法分别同步测定3种水提物中5种主要游离蒽醌大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚的含量；分别以浓度为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL的3种中药水提物溶液处理HepaRG细胞48 h后，加入噻唑兰检测其活力；分别以1.5、2.0、2.5 mg/mL的3种中药水提物溶液处理HepaRG细胞48 h后，Annexin Ⅴ/PI双染后流式细胞术检测凋亡细胞比例。结果：何首乌水提物中主要游离蒽醌含量为0.229%，虎杖水提物中为0.545%，大黄水提物中为2.593%；何首乌水提物（2.0、2.5、3.0 mg/mL）、虎杖水提物（1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL）、大黄水提物（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL）均可抑制HepaRG细胞活力，且抑制程度与主要游离蒽醌含量呈正相关；细胞凋亡实验结果表明，3种中药水提物（1.5、2.0、2.5 mg/mL）均明显诱导HepaRG细胞凋亡，且凋亡率与主要游离蒽醌含量呈正相关。结论：3种中药水提物中主要游离蒽醌含量由低到高依次为何首乌、虎杖、大黄，该含量与其体外肝细胞毒性作用成正相关，提示游离蒽醌可能是3种中药产生肝细胞毒性的重要成分。