人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因消减cDNA文库的构建和初步筛选

背景与目的 筛选肺癌转移相关基因有助于阐明肺癌侵袭转移的分子机理.为了筛选不同转移潜能肺癌的转移相关差异表达基因,本研究构建不同转移潜能的人大细胞肺癌细胞株NL9980和L9981间差异表达基因的消减cDNA文库,并对消减文库进行初步筛选.方法 应用抑制消减杂交技术构建人大细胞肺癌高低转移株NL9980与L9981间差异表达基因的正向消减cDNA文库和反向消减cDNA文库,利用α互补原理,经蓝白菌落初步筛选获得阳性克隆,应用斑点杂交的方法对正向和反向消减cDNA文库进行杂交筛选.结果 成功构建了人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因的正向消减cDNA文库和反向消减cDNA文库.经蓝白菌落筛选和斑点杂交,正向消减文库获得了307个阳性克隆,反向消减文库获得了78个阳性克隆.结论 抑制消减杂交是克隆差异表达基因的有效方法,利用此方法可以成功构建人大细胞肺癌高低转移株差异表达基因消减cDNA文库.不同转移潜能人大细胞肺癌细胞株中存在可能与转移相关的差异表达基因.     

野生型和突变型nm23-H1基因原核表达载体的构建、表达及纯化

背景与目的 nm23-H1基因是一个肿瘤转移抑制基因,但关于nm23-H1基因抑制肿瘤转移的生化机理目前并不清楚.该实验目的就是构建nm23-H1野生型和P96S、H118F突变型原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化.方法 通过PCR方法扩增野生型和突变型nm23-H1目的片断,利用基因重组技术构建pET28a-nm23-H1野生型和突变型原核表达载体,并进行酶切和测序鉴定,鉴定正确克隆转化BL21(DE3)溶源菌,进行蛋白表达及可溶性分析,同时采用镍柱亲和层析法进行纯化,应用Western blot方法对纯化后蛋白进行鉴定检测.结果 通过酶切和测序鉴定,pET28a-nm23-H1野生型和突变型原核表达载体序列正确,编码框正确.转化溶源菌后能够表达目的蛋白,蛋白表达量高,且均为可溶性蛋白,Western blot检测结果提示野生型和突变型nm23-H1蛋白分子量为20 kDa,与预计值相符.结论 成功构建pET28a-nm23-H1野生型和P96S、H118F突变型原核表达载体,所表达蛋白可用于下一步实验研究.     

187例非小细胞肺癌中EGFR基因突变和扩增的检测及其临床意义

背景与目的 现有的研究表明表皮生长因子受体(EGFR)相关信号通路在肺癌的发生和发展中起重要作用.EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)是目前针对EGFR治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的重要分子靶向药物.EGFR的不同存在状态(基因突变和基因扩增)与TKIs的疗效相关.本研究旨在探讨非小细胞肺癌患者中EGFR的存在状态及其临床意义,从而为肺癌病人"个体化分子治疗"提供依据.方法 研究对象为187例NSCLC病例.用Real-time PCR技术检测EGFR基因19、21外显子的突变状态;用荧光原位杂交(FISH)技术检测EGFR基因的扩增情况,并进一步分析EGFR基因的突变和扩增与患者临床病理生理特征的关系.结果 :FISH结果显示,47.6%(98/187)的肺癌患者存在EGFR基因的扩增,而EGFR基因的扩增与患者的年龄、性别、组织学类型、吸烟状态及是否存在转移无关(P>0.05);Real-time PCR结果显示:20.3%(38/187)的肺癌患者存在EGFR外显子19、21的突变.EGFR基因突变率在女性(32.3%vs14.4%男性)、腺癌(35.5%vs9.9%非腺癌)、不吸烟(38.2%vs10.1%吸烟)患者中明显高(P<0.05).EGFR基因扩增与基因突变之间具有一定的相关性,在早期肺癌、腺癌及非吸烟的女性患者中,EGFR基因外显子突变常同时伴有EGFR基因的扩增.有EGFR基因突变或/和基因扩增的患者生存期均高于无EGFR基因异常者,但是没有统计学差异(P>0.05).有EGFR基因突变的患者易对TKIs治疗有效.结论 EGFR基因突变率在不同的NSCLC患者中不同,其中,在女性、腺癌和不吸烟患者中突变率高;层GFR基因扩增与患者的性别、组织类型、吸烟状态等临床特征无明显关系,与患者预后的相关性有待进一步研究.     

弹性棉签外固定治疗连枷胸45例

目的：观察弹性棉签外固定方法在连枷胸治疗中的应用效果。 方法：选择1999-01/2006-12眉山市第二人民医院胸外科收治的连枷胸患者45例，均有3根及以上的肋骨骨折，并有不同程度的反常呼吸运动。所有患者对实验及治疗方案均知情同意。入院后首先用划线笔对胸壁的浮动范围作好标记，确定无骨折的肋骨作为支撑点；根据患者胸廓大小和骨折部位的不同选择不同长度的弹性棉签（直径约0.3 cm，13~23 cm长短不等，两端磨钝备用），在胸壁软化区用体积分数为0.75的乙醇溶液去脂后，超过反常活动区边缘前后约3 cm、上下各一肋骨平铺第一层宽胶布，避免弹性棉签与皮肤的直接接触；然后在其上自前向后栅栏样（均匀相隔3 cm）与肋骨纵轴垂直地摆放与第一层宽胶布同样长度的弹性棉签数根（两端略大于浮动范围的横径）；最后在弹性棉签上超过其边缘1 cm平铺第二层宽胶布条，固定棉签；皮肤破损处给予开窗处理；如需引流，可在引流管放置后再施行固定；外固定时间需2周左右。弹性棉签外固定后12 h检测血气分析。 结果：经弹性棉签外固定胸壁后，软化胸壁的反常活动得以控制，呼吸困难缓解，PaO2，PCO2及pH值明显好转，与固定前比较，差异有显著性意义（P < 0.001）；对合并呼吸功能不全的患者，联用机械通气治疗，呼吸机辅助呼吸时间较短。 结论：弹性棉签外固定治疗浮动胸壁无创、操作简单、经济，疗效显著；连枷胸合并急性呼吸功能不全时，同期联合应用机械通气和胸壁弹性棉签外固定是行之有效的方法。     

转移抑制基因nm23-H1参与肺癌Ras信号传导机理研究

背景与目的nm23-H1基因已被证实为一种肿瘤转移抑制基因,但其作用机理尚不明了,本研究探讨nm23-H1参与肺癌Ras信号传导的机理。方法应用脂质体法将pEGFP-nm23-H1野生型和突变型质粒(WT,H118F,S120G,P96S,S44A)转染人大细胞肺癌细胞株L9981,采用免疫共沉淀与Western blot方法检测野生型和突变型nm23-H1蛋白与Ras支架蛋白KSR的关系。结果在转染了野生型和突变型质粒的五个细胞株中,鼠抗nm23-H1免疫沉淀物在86KDa处可检测到KSR的阳性条带,而各组KSR的量应用单因素方差分析比较无显著性差异(F=0.190,P=0.938)。结论本研究结果表明nm23-H1与KSR存在相互作用,但这种相互作用与nm23-H1有无突变及突变位点无关,nm23-H1可能是通过KSR参与肺癌Ras信号传导的。     

Ras激酶抑制子KSR定点突变、表达和鉴定

背景与目的 Ras to MAPK通路在生长、发育信号传递中起关键的作用。Ras激酶抑制基因（KSR）是该通路中的一个重要组分，其功能主要是作为一个支架蛋白协调装配包含有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）及其上游调控子的多蛋白复合体。已有的研究表明KSR有许多磷酸化位点，这些位点磷酸化状态的改变与外界信号刺激有着极为密切的关系。利用定点突变技术可以准确地改变基因特定碱基序列，获得突变蛋白质。本研究的目的是应用定点突变技术构建突变型KSR，并将其瞬时转染293T细胞所表达蛋白纯化和鉴定，为进一步研究KSR生化作用机制提供理论和实验依据。方法 以本实验室自己构建的pCMV-Tag2b-KSR质粒为模板，应用本实验室改进的QuikChang^tm定点突变方法，引入KSR12个突变位点，构建突变型pCMV-Tag2b-KSR，并将其瞬时转染293T细胞进行蛋白表达，亲和胶纯化并经SDS-PAGE和蛋白质印迹鉴定。结果 成功构建了2个突变型KSR基因，经DNA序列分析突变碱基，证实位点正确，并经过瞬时转染293T细胞表达出突变体蛋白，纯化蛋白经SDS-PAGE和蛋白质印迹鉴定与实验设计完全一致。结论 成功构建了2个具有不同突变位点的突变型KSR，为以后进行蛋白功能研究提供实验基础。     

LAPTM4B基因多态性与肺癌易感性的关系

背景与目的已有的研究结果显示溶酶体相关4次跨膜蛋白质β（lysosome-associated protein transmembrane 4 beta，LAPTM4B）在肿瘤发生中发挥重要的作用，研究认为LAPTM4B的基因型＊2／＊2与肝癌易感性密切相关。本研究旨在探讨LAPTM4B基因多态性与肺癌易感性的关系。方法以病例对照研究的方法，用基于特异性引物的PCR对131例非小细胞肺癌患者和104例正常人进行LAPTM4B基因分型，用χ^2检验分析肺癌组和对照组基因型频率和其它参数的分布。结果LAPTM4B的等位基因＊1和＊2在肺癌组中的频率分别为74．8％和25．2％，在对照组分别为72．1％和27．9％，二组间等位基因分布频率比较差异无统计学意义（P=0．510）。LAPTM4B的基因型＊1／＊1，＊1／＊2和＊2／＊2在肺癌组分别为53．4％、42．7％和3．8％，在对照组分别为54．8％、34．6％和10．6％，两组间三种基因型分布频率比较差异无统计学意义（P=0．087）。LAPTM4B基因型分布与患者的病理类型和临床分期等均无明显关系。结论本研究未观察到LAPTM4B基因多态性与肺癌易感性之间存在统计学相关关系。     

小鼠Ras激酶抑制剂(KSR)基因氨基端和羧基端真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

背量与目的已有的实验证据表明，Ras激酶抑制剂（kinase suppressor of Ras，KSR）的功能主要是作为一个支架蛋白组装MAPK及其上游调控子形成多蛋白的复合体。但KSR是否存在激酶活性，一直是争论的焦点。本研究的目的是构建小鼠KSR基因氨基端（N-KSR）和羧基端（C-KSR）的真核表达载体，并观察其在293T细胞中的表达。方法通过PCR方法扩增N-KSR和C-KSR目的片段，利用基因重组技术构建pCMV-Tag2b-N－KSR和pCMV-Tag2b-C－KSR真核表达载体，并进行酶切和测序鉴定。鉴定正确的克隆瞬时转染293T细胞，通过Western blot方法检测目的蛋白的表达。结果通过酶切和测序鉴定，pCMV-Tag2b-N-KSR和pCMV-Tag2b-C-KSR真核表达载体序列正确，编码框正确。转染后的293T细胞经Western blot检测，能够表达目的蛋白。结论成功构建了pCMV-Tag2b-N-KSR和pCMV-Tag2b-C-KSR真核表达载体并可在293T细胞中表达，为以后的研究奠定了基础。     

hTERT启动子的克隆及其在端粒酶阳性肺癌细胞中的靶向转录活性研究

目的克隆人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子序列片段，并探讨hTERT启动子在肿瘤细胞中的靶向转录活性。方法用PCR方法克隆293细胞DNA hTERT 5＇端上游旁侧序列长约1．1kb的启动子片段，经测序无误后将其克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic的荧光素酶基因上游，构建pGL3-hTERTp重组质粒，瞬时转染肺癌细胞A549、SPC-A-1、LTEPα-2、NCI-H446、YTMLC-9、GLC-82、95D、A2以及正常成纤维细胞MRC-5，检测荧光素酶活性。并用RT-PCR和TRAP-ELISA方法分析各细胞hTERT mRNA的表达及其端粒酶活性。结果琼脂糖电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1．1kb，DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致，位于hTERT基因转录起始位点上游1126bp（-1126～-40），片段长度为1084bp；采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL3-hTERTp重组质粒，均显示构建成功；hTERT mRNA和端粒酶活性在肺癌细胞中呈不同水平的表达，而正常细胞则均为阴性；瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示，hTERT启动子片段在所有检测的肺癌细胞中均有高低不同的转录活性，在正常细胞MRC-5无转录活性。结论克隆的1084bp大小的hTERT启动子片段在hTERT mRNA和端粒酶阳性的肺癌细胞中有特异性的转录活性，hTERT启动子可能作为靶向性基因治疗的调控元件。     

非小细胞肺癌中VEGF表达、MVD值与临床病理特征相关性研究

检测非小细胞肺癌(N SCLC)中血管内皮生长因子(VEGF)的表达、微血管密度(M VD),探讨二者之间和临床病理特征的相关性。利用免疫组织化学方法测定32例N SCLC患者中VEGF表达及M VD,并与临床病理特征相比较。结果N SCLC患者VEGF阳性表达率90.6%,明显高于肺良性病变组织阳性表达率12%(P<0.05),N SCLC、肺良性病变组织中的M VD分别为(32.82±19.45)、(14.33±10.57)条/0.723 mm2,P<0.05;二者均与肿瘤TNM分期及淋巴结转移有关(P<0.05);VEGF表达与M VD值呈正相关性。M VD值、VEGF在肺部良恶性肿瘤组织中表达水平不同,并与恶性肿瘤TNM分期、淋巴结转移相关。