苯并[a]芘恶性转化细胞T-16HBE-C1与非转化细胞16HBE基因表达谱差异分析CSCD

目的比较苯并[a]芘(BaP)恶性转化细胞T-16HBE-C1与非转化细胞16HBE全基因组表达谱差异,为进一步阐明BaP致癌机制和筛选BaP致癌生物学标志提供线索。方法选择BaP恶性转化细胞T-16HBE-C1与非转化细胞16HBE作为BaP致癌机制研究模型,利用人全基因组表达谱芯片Human mRNA OneArray?HOA v7 Microarrays筛选细胞间差异表达基因。继而对差异表达基因进行生物信息学分析,包括利用DAVID数据库对差异表达基因进行GO分析和KEGG通路分析。结果人全基因组表达谱芯片共发现689个基因在T-16HBE-C1和16HBE细胞中表达差异在2倍以上(P<0.05),其中339个基因在T-16HBE-C1细胞中的表达高于16HBE细胞,350个基因在T-16HBE-C1细胞中的表达低于16HBE细胞。差异表达基因涉及多种生物学改变,主要包括肿瘤信号转导、细胞增殖与凋亡、细胞代谢和细胞黏附等。结论人支气管上皮16HBE细胞经BaP恶性转化后基因表达谱发生明显改变,差异表达基因可能在BaP致癌中发挥作用,并可能作为BaP致癌的潜在生物学标志。     

基于肿瘤基因组图谱数据库探索性筛选潜在泛癌生物标志物

目的: 基于肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)数据库筛选潜在泛癌生物标志物,为多种肿瘤的诊断和预后评估提供帮助。方法: 利用“GDC Data Transfer Tool”和“GDCRNATools”软件包获取TCGA数据库,完成数据整理,将13种肿瘤纳入研究。以错误发现率(false discovery rate, FDR) <0.05且差异倍数(fold change, FC) >1.5作为差异表达标准,筛选在13种肿瘤中均上调或均下调的基因和微小RNA(microRNAs,miRNAs)。利用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve, ROC曲线)的曲线下面积(area under the curve, AUC)、最佳截断值及对应的灵敏度和特异度反映诊断价值。利用Kaplan-Meier法计算生存概率后进行对数秩(log-rank)检验并计算风险比(hazard ratio, HR)反映预后评估价值。利用DAVID工具对差异表达基因进行GO (Gene Ontology)、KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。利用STRING和TargetScan工具对差异表达基因和miRNAs进行调控网络分析。结果: 共发现48个基因和2个miRNAs在13种肿瘤中均差异表达,其中25个基因均表达上调,23个基因和2个miRNAs均表达下调。多数差异表达基因和miRNAs区分病例和对照的能力较好,AUC、灵敏度和特异度可达0.8~0.9。生存分析结果显示,差异表达基因和miRNAs与多种肿瘤患者的生存显著相关,且多数上调基因是患者生存的危险因素(HR>1),而多数下调基因是患者生存的保护因素(0<HR<1)。GO和KEGG富集分析显示,差异表达基因多富集于与细胞增殖有关的生物学事件。在调控网络分析中,共13个基因和2个miRNAs存在调控和相互作用关系。结论: 在13种肿瘤中均差异表达的48个基因和2个miRNAs可能作为潜在泛癌生物标志物,为多种肿瘤的诊断和预后评估提供帮助,并为发展肿瘤治疗的广谱靶点提供线索。     

吴茱萸碱对HepG2细胞毒性及其机制

目的:研究吴茱萸碱(evodiamine,EVO)的肝细胞毒性及其机制。方法:将0.04~25 μmol/L EVO分别作用于HepG2细胞24、48和72 h,用细胞增殖及毒性检测(cell counting kit-8,CCK-8)法检测细胞存活率。0.2、1和5 μmol/L EVO处理HepG2细胞48 h,多功能酶标仪分别检测细胞培养上清液中谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,以及总胆红素(total bilirubin,TBIL)含量。用多功能酶标仪检测HepG2细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。用分子对接探究EVO与凋亡、自噬和铁死亡相关蛋白结合情况。用线粒体膜电位荧光探针(superior alternative to JC-1,JC-10)和异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白/碘化丙啶(annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide,Annexin V-FITC/PI)对HepG2细胞进行染色,流式细胞仪分别检测细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)和细胞凋亡。用Western blot检测HepG2细胞凋亡相关蛋白caspase-9,caspase-3以及胆汁酸转运体胆盐输出泵(bile salt export pump,BSEP)和多耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)的表达水平。结果:0.04~25 μmol/L EVO可降低HepG2细胞存活率,具有时间和剂量依赖关系。EVO处理HepG2细胞24、48和72 h的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC₅₀)分别为85.3、6.6和4.7 μmol/L。0.2、1和5 μmol/L EVO作用HepG2细胞48 h,细胞培养上清液中ALT、AST、LDH、ALP活性升高,TBIL含量增加。EVO可降低细胞中SOD活性,增加MDA含量。分子对接结果显示EVO与凋亡相关蛋白结合情况较好,JC-10和Annexin V-FITC/PI染色发现EVO可降低MMP,增加细胞凋亡率。Western blot结果表明EVO可上调caspase-9剪切蛋白和caspase-3剪切蛋白表达,并下调caspase-3前体蛋白、BSEP和MRP2蛋白表达。结论:0.2、1和5 μmol/L的EVO具有肝细胞毒性,其毒性机制可能涉及脂质过氧化损伤、细胞凋亡和胆汁淤积。     

ALCAM基因敲除对苯并[a]芘恶性转化细胞THBEc1转录组的影响

目的检测活化白细胞黏附分子(ALCAM)基因敲除后苯并[a]芘(BaP)恶性转化细胞THBEc1转录组的改变,探究ALCAM在BaP致癌中的作用,为进一步阐明BaP致癌机制提供线索。方法选择两株ALCAM基因纯合敲除THBEc1细胞THBEc1-ΔALCAM-c5和THBEc1-ΔALCAM-c7及一株敲除对照细胞THBEc1-ctrl作为模型,利用转录组测序技术筛选细胞间差异表达基因,使用DAVID数据库对差异表达基因进行GO分析和KEGG通路富集分析。利用克隆形成实验检测ALCAM敲除对THBEc1细胞增殖的影响。结果转录组测序共发现336个基因在两株ALCAM敲除THBEc1细胞和THBEc1-ctrl细胞中表达差异在2倍以上(FDR<0.05),其中62个基因在两株ALCAM敲除THBEc1细胞中的表达低于THBEc1-ctrl细胞,274个基因在两株ALCAM敲除THBEc1细胞中的表达高于THBEc1-ctrl细胞。差异表达基因涉及多种生物学功能,主要包括细胞增殖、迁移、黏附、信号转导、凋亡、血管生成、炎症反应和免疫应答等。克隆形成实验证实ALCAM敲除可降低THBEc1细胞增殖能力。结论敲除ALCAM后BaP恶性转化细胞THBEc1转录组明显改变,增殖能力明显降低。ALCAM可能在BaP致癌中发挥重要作用,并可能作为BaP致癌的潜在生物标志物。