铁皮石斛居群差异的研究（Ⅰ）——植物体形态结构的差异

目的：比较分析广西，贵州，云南三省区的铁皮石斛主要居群形态结构的差异。方法：运用光镜对铁皮石斛茎进行比较解剖。结果：将采集到的我国铁皮石斛主产区的主要居群分为二种类型：F型和H型。F型植株的茎相对短而柔软，具粘性，适宜加工成铁皮枫斗；其中广西西林居群和云南广南居群茎的表皮具有较丰富的蜡质，不具下皮层，横切面上维管束密度小，维管束内外侧纤维群不发达，茎尤为柔软，是加工铁皮枫斗的优质居群。H型植株的茎较长，质地较硬，粘性差，不适宜加工成铁皮枫斗。结论：F型和H型居群铁皮石斛茎的形态结构具有明显差异，弄清铁皮石斛居群差异对指导铁皮石斛的采收、加工以及大面积人工繁殖具有重要意义。     

铁皮石斛的组织培养研究

本文通过实验总结出组培铁皮石斛各个阶段的培养基。诱导培养基N_6 BA2.5mg/L;N_6 BA2.5mg/L IBAO.5mg/L;分化培养基N_6 BA1.5mg/L NAA1.2mg/L 5％香蕉汁;生根壮苗培养基N_6 NAA2.5mg/L 1O％土豆汁。     

铁皮石斛的栽培研究

本文总结了铁皮石斛组培苗移栽的最佳时间、最佳基质及温湿度的控制,使铁皮石斛的栽培变得简单易行。     

花椒及其混淆品的rDNA ITS区序列分析与鉴别

目的研究不同居群的花椒及其混淆品的rDNA ITS区碱基序列的特征及其差异，为花椒的鉴别提供可靠的分子标记。方法运用PCR产物直接测序和克隆测序法对甘肃、陕西、四川、河北等7个花椒居群及3个混淆种的rDNA ITS区(包括ITS1，5.8S，ITS2)碱基序列进行序列测定。结果首次报道花椒ITS区的碱基序列，序列总长度为619-620 bp，长度变异较少，与混淆种长度仅相差4 bp。花椒各居群中，rDNA ITS区碱基序列有15个变异位点、12个信息位点、3个特异性识别位点。与混淆品间的碱基差异则较为显著，多达71个变异位点，有4个花椒特异性识别位点。结论依据花椒ITS区的序列特征可准确鉴别各居群的花椒及其混淆品；亲缘关系密切的花椒居群在地理位置上也非常靠近；rDNA ITS序列特征可作为花椒种内和种间鉴别的有效分子标记。     

金钗石斛的位点特异性PCR鉴别研究

目的建立一种简便、实用的金钗石斛的DNA分子鉴别方法。方法根据金钗石斛及其他黄草类、枫斗类石斛的rDNA ITS序列数据库,寻找金钗石斛特异性的序列位点,设计专用于金钗石斛鉴别的PCR引物,用该引物在不同条件下扩增石斛属植物的模板DNA,建立只有金钗石斛具有阳性扩增的PCR鉴别条件。结果在66℃、40 s的复性条件下进行鉴别PCR,金钗石斛的模板DNA扩增出约300 bp的阳性扩增带,而其他39种石斛的模板DNA在同样条件下无扩增产物。结论运用位点特异性PCR能有效地从其他石斛属植物中鉴别出金钗石斛,该方法具有高效、准确、简便、省时的特点,应用前景广泛。     

铁皮石斛居群差异的研究ⅡISSR指纹标记方法的建立与优化

目的:针对铁皮石斛ISSR的反应特点,建立稳定可靠的ISSR分子指纹标记反应体系,为进一步研究铁皮石斛的居群差异奠定基础。方法:通过筛选引物并设定影响铁皮石斛ISSR反应的诸因子的不同浓度,检测IS-SR不同反应体系的扩增效果;通过分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化,建立铁皮石斛ISSR稳定可靠的反应体系。结果与结论:首次建立了可用于铁皮石斛ISSR-PCR分析的最适宜的反应体系:25μL PCR反应体系中,10×Taq酶配套缓冲液,1.5 U Taq DNA聚合酶,1.2～1.8 mmol.L^-1MgCl₂,80μmol.L^-1dNTP,0.2μmol.L^-1引物,DNA模板约20 ng,退火温度52～60℃;实验表明:Taq酶质量、DNA模板品质、退火温度等对ISSR反应结果具有较大影响。所建立的铁皮石斛ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可以较好地应用于铁皮石斛的居群鉴别及居群分子生态的研究。     

长江中下游地区菱属植物的DNA分子鉴别

目的 对野生菱和栽培菱种rDNA ITS片段进行分析，探讨该片段在两大群体中的系统学及鉴别研究意义。方法 对菱的rDNA ITS区进行了PCR扩增、测序，运用clustal、Mega 2．0等软件对ITs区进行序列分析鉴别。结果 获得rDNAI TS1、ITS2和5．8S rDNA完整序列，10个居群菱的ITS1与ITS2序列的长度分别为234～236 bp和220～221 bp，5．8S区均为164bp，不同居群的碱基差异为0．22％～2．94％。变异位点数为16个，信息位点数6个。用NJ法根据ITS序列数据构建系统发生树。结论 尽管菱属各居群间rDNA ITS的差异百分率较小，其亲缘关系较近，但根据ITS序列的特征可以很好地鉴别野生菱、栽培菱，菱属植物有可能都起源于同一种野生类居群。     

铁皮石斛野生居群遗传多样性的RAPD分析与鉴别

目的采用RAPD分子标记技术，对铁皮石斛8个野生居群的遗传多样性、亲缘关系以及分子鉴别等进行研究。方法筛选随机引物进行RAPD分析，通过UPGMA聚类，研究铁皮石斛各居群间的遗传关系，构建居群亲缘关系的分子系统树；利用特异性条带对铁皮石斛野生居群进行指纹分析鉴别。结果共筛选出10个有效引物，在8个野生居群材料的RAPD扩增中共得到439个位点，平均每个引物扩增出43.9个位点，每个居群扩增出54.9个位点；在所获得的104条可重现谱带中，9条是单态的，95条是多态的，多态性程度达91.35%，遗传距离在0.590～0.727之间，平均为0.686。结论铁皮石斛居群间遗传差异明显，具有较丰富的遗传多样性；RAPD可以作为铁皮石斛野生居群遗传多态性、居群亲缘关系和分子鉴别研究的有效手段；引物S412可以有效鉴别铁皮石斛的8个野生居群。     

F型、H型居群的铁皮石斛rDNAITS区序列差异及SNP现象的研究

目的 :研究铁皮石斛主产区F型和H型居群rDNAITS碱基序列的差异。方法 :运用PCR直接测序法对广西、贵州、云南铁皮石斛主要居群的rDNAITS区 (包括ITS1,5 .8SrDNA ,ITS2 )碱基序列进行了序列测定。结果 :在铁皮石斛各居群中 ,F型居群与H型居群植株的rDNAITS区碱基序列有 2个位点差异 ,且变异分别发生在ITS1区及 5.8S区内。研究表明 :铁皮石斛居群内部rDNAITS区的差异与植物生活型的差异呈一定的相关性 ,H型居群的铁皮石斛是F型的变种。在F型与H型居群间 ,其 5.8SrDNA区存在单核苷酸多态 (SNP)现象。首次报道了铁皮石斛ITS区的碱基序列 ,ITS区总长度为 634bp ,其中ITS1为 231bp ,5.8S为 163bp ,ITS2为 240bp。结论 :rDNAITS区碱基序列的比较分析进一步证明铁皮石斛F型居群与H型居群间具有显著的差异性。     

齿瓣石斛的位点特异性PCR鉴别

目的设计出齿瓣石斛的位点特异性鉴别引物,仅通过PCR就能完成对齿瓣石斛真伪进行准确鉴别。方法根据齿瓣石斛及其他枫斗类、黄草类石斛的rDNA ITS序列数据库,设计了齿瓣石斛的位点特异性PCR鉴别引物JB-Chiban-01S和JB-Chiban-01X。然后,对38种石斛属植物模板DNA进行了PCR扩增,阳性者即为齿瓣石斛正品。结果当退火温度设定为58℃时,只有齿瓣石斛的模板DNA能被扩增出来,而其他的37种石斛属植物均为阴性。该鉴别反应重复性好,已在鉴别齿瓣石斛时发挥重要作用。结论运用位点特异性鉴别引物能成功地对齿瓣石斛进行PCR鉴别,与DNA测序鉴别方法相比,位点特异性PCR具有高效、准确、简便、省时等优点。