骨组织工程再血管化种子细胞来源:兔肾微血管内皮细胞体外培养及其细胞表型的研究

背景在骨组织工程研究中,面临从体外实验过渡到体内成骨时如何快速血管化的问题,尽早建立血运才能保留组织工程骨的成骨优势.在体外短时间内能大量扩增且纯度较高的细胞,才能成为组织工程化骨再血管化理想的种子细胞.目的探索肾微血管内皮细胞的体外培养方法,并对其进行鉴定和表型研究,拟为骨组织工程再血管化提供理想的种子细胞.设计单一样本研究.单位苏州大学附属儿童医院骨科,苏州大学生命科学院生物技术研究所.材料实验于2003-05/2004-04在苏州大学附属儿童医院骨科实验室完成.实验材料为CO2培养箱,M199,胎牛血清,Ⅳ型胶原酶,40 g/L多聚甲醛,20 g/L戊二醛,ECGF,鼠抗人第八因子单克隆抗体(抗FⅧ-RAg),多标记免疫分析系统(1 420,WALLAC BLCTOR2),离心机,倒置显微镜,免疫荧光显微镜等.方法采用三步梯度筛网法,先获得较高纯度的肾血管球,再应用肾血管球外植法体外培养肾微血管内皮细胞.进一步对肾微血管内皮细胞进行免疫组化法的Ⅷ因子相关抗原鉴定,用透射电镜观察细胞浆Weibel-Palade小体,以及采用间接免疫荧光法检测CD31,CD34及CD44表达.主要观察指标肾微血管内皮细胞形态、活性及表型.结果体外培养出纯度很高的血管内皮细胞并培养了11代.此外,免疫组化显示Ⅷ因子相关抗原阳性,电镜下观察到Weibel-Palade小体,以及间接免疫荧光检出CD31,CD34表达阳性,而CD44阴性.结论本实验方法可成功培养出肾微血管内皮细胞,且后者表达CD31,CD34细胞表型.     

骺板软骨细胞的体外培养及鉴定

目的:建立体外培养及鉴定骺板软骨细胞的方法。方法:实验于2005-03/2006-05在苏州大学附属儿童医院骨科实验室完成。选用3只生后14～28d的新西兰幼兔,空气栓塞处死,暴露股骨下端和胫骨上端,分别取2处的骺板组织,将其剪切成1～3mm3的小块,经胰蛋白酶消化,接种于含150g/L牛血清的1640培养基中,饱和湿度培养,传代。①细胞接种后3h在倒置显微镜下观察细胞生长情况,见细胞贴壁后每天观察2次。②第2代细胞达到80%～90%左右汇合时采用常规苏木精-伊红染色,光镜观察细胞爬片情况。③第3代细胞爬片至细胞达到80～90%左右汇合时,采用苏木素染色3min,3%亮绿染色5min,蕃红花“O”染色5min,光镜观察细胞产生蛋白聚糖情况。④采用PCR检测细胞Ⅱ型胶原的表达。⑤采用四唑盐MTT比色法检测细胞活性。结果:①骺软骨细胞刚接种后呈大小不等之圆形悬浮于培养液中,3h后见大部分细胞贴壁,24h后贴壁细胞呈短梭形、圆形、三角形和不规则形,见细胞分裂相。48h后见细胞伸展明显,细胞分裂相每高倍镜视野可见多个。经隔日换液细胞生长至第5天,细胞呈聚集生长,达到汇合状态,将细胞传代。接种后第1代细胞2d后呈梭形,培养4d传至第2代,第2代细胞长满瓶底后,90%呈胞膜较厚的圆形,10%为梭形,第3代、第4代亦如此。传至第5代见肥大细胞增多,细胞松散,折光性减弱,呈凋亡状态。②细胞爬片后观察骺软骨细胞形态以梭形居多,同时也有圆形、三角形和不规则形。可见细胞分裂及细胞中的分泌小泡。③见细胞呈红色,无绿色,证明蕃红花“O”-亮绿染色阳性,显示所培养的细胞可以分泌蛋白聚糖。④PCR检测术所养细胞含有Ⅱ型胶原,电泳带在440bp上。⑤四唑盐MTT比色法检测显示,第3代骺软骨细胞的生长曲线近似倒“S”形,在第4,5,6天细胞呈对数生长,约在7,8,9,10d达平台期,至第12天细胞出现生长抑制。结论:建立了骺板软骨细胞的体外培养方法,并证实所培养出的细胞分泌蛋白聚糖和Ⅱ型胶原,具有软骨细胞的共同特点。     

兔血管内皮细胞和诱导成骨细胞在可注射纳米材料上的共培养

目的：将可注射纳米骨材料与共培养的兔肾血管内皮细胞和兔骨髓间充质干细胞诱导的成骨细胞复合,并构建可注射细胞型纳米组织工程骨,观察它们体外培养的相容性. 方法：实验于2003-09/2004-11在苏州大学附属儿童医院完成.①实验材料：取16周龄雄性新西兰大耳白兔,体质量1.5 kg左右.②实验方法：麻醉后抽取兔骨髓,用淋巴细胞分离液分离出其中的间充质干细胞,在含体积分数为0.15牛血清的RPMI1640液中培养.骨髓间充质干细胞在条件培养基中,7 d后可见细胞变为多边形,碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原染色阳性,形成钙结节,表现成骨细胞分化特点.采用三步梯度筛网法,获得肾血管球,5 g/L胶原酶Ⅳ37℃消化15～20 min,离心沉淀获取血管内皮细胞,在含体积分数为0.15小牛血清的M199中培养.③实验评估：免疫组织化学法进行第Ⅷ因子相关抗原鉴定,透射电镜观察细胞浆Weibel-Palade小体,间接免疫荧光法检测CD31、CD34及CD44的表达.将共培养的兔肾血管内皮细胞、成骨细胞与可注射纳米骨材料体外复合培养,进行形态学观察和功能测定. 结果：①在一定培养条件下成功诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化.②培养的血管内皮细胞免疫组织化学法检测第Ⅷ因子相关抗原阳性,透射电镜观察到细胞浆中的Weibel-Palade小体,间接免疫荧光法检测CD31、CD34表达阳性,CD44阴性.③共培养的兔肾血管内皮细胞、成骨细胞在可注射纳米骨材料上生长、增殖良好,细胞活性和碱性磷酸酶活性未受到影响. 结论：可注射纳米骨材料具有良好的细胞相容性,可作为骨组织工程理想的可注射载体材料.     

可降解多孔丝素材料应用于骺板组织工程的可行性研究

目的 为骺板组织工程寻找生物相容性良好的支架材料.方法 将体外培养的第三代骺板软骨细胞与可降解多孔丝素材料复合.应用扫描电镜、激光共聚焦显微镜、MTT等方法,对骺板软骨细胞与可降解多孔丝素材料的生物相容性进行观察.结果 骺板软骨细胞在可降解多孔丝素材料上生长良好,随着培养时间的延长,骺板软骨细胞逐渐增多.结论 可降解多孔丝素材料具有良好的生物相容性,可以作为骺板组织工程理想的支架材料.

Abstract：

Objective To assessfind the biocompatibility of scaffold SF for epiphyseal plate tissue engineering. Methods To culture the epiphyseal plate chondrocyte on scaffold SF. We studied biological characteristics of the cells by applying the ways of scanning electron- microscope, laser scan confocal microscope and MTT test. Results The epiphyseal plate chondrocyte grew well on scaffold SF. Conclusions The scaffold SF have good biocompatibility and can be used as ideal scaffold in epiphyseal plate tissue engineering.     

小儿颅脑外伤合并股骨干骨折23例救治分析

目的探讨小儿颅脑外伤合并股骨干骨折损伤机制、救治措施及预后。方法总结我科近4年来住院病例。探讨股骨受暴力后颅脑损伤的机制,股骨干骨折手术时机的选择以及预后。结果此类患儿系暴力撞击大腿后,头部着地造成减速伤,颅脑受伤机制中有剪切力存在。除2位轻型颅脑外伤患儿外,中重型颅脑外伤患儿入院CT大都表现白质及灰白质交界处、基底节及胼胝体处多发点灶样挫伤。患儿昏迷时间为5～178天,平均23.1±4.2天。患儿吞咽功能恢复后行弹性髓内钉固定术效果好,肺部并发症较轻。结论收住神经外科颅脑外伤合并股骨干骨折患儿颅脑受伤机制大都伴有剪切力存在。虽然颅脑损伤严重,但大部分患儿经过正确的治疗仍可获得较好的预后。     

Ilizarov技术结合髓内克氏针治疗先天性胫骨假关节

目的介绍用Ilizarov技术结合髓内克氏针治疗先天性胫骨假关节的临床经验和疗效.方法4例术前均经数次手术,1例为初诊,通过截去假关节和病变骨膜,用克氏针进行力线矫正急性肢体短缩并上伊氏环急性断端加压,4例同时行胫骨近端截骨延长.结果5例均取得骨性愈合,1例出现再骨折,均残留轻度足外翻畸形.结论Ilizarov技术结合髓内克氏针临床疗效可靠,拆除外固定架后仍需长期支具保护.     

婴幼儿结核性腹膜炎所致粘连性肠梗阻

目的 婴幼儿时期粘连性肠梗阻临床上较常见，而结核性腹膜炎引起粘连性肠梗阻则少见。我们在临床上处理6例，有误诊教训。方法 本文报告6例详细病例资料，回顾性分析其中4例在术前诊断为肠梗阻，其中2例在术前诊断为腹部肿瘤压迫浸润所致粘连性肠梗阻，经过手术中探查处理，发现4例为腹膜肠浆膜大网膜粟粒性结核引起粘连性肠梗阻，2例为干酪样坏死形成粘连包块引起粘连性肠梗阻。结果 本组均经病理组织学检查证实，术中4例做捷径手术，本组中有2例肿块患儿作了病灶清除术加腹腔引流术。梗阻缓解。结论 术后应用抗结核治疗，创口一期愈合，出院后继续抗结核治疗，每一患儿链霉素15～20g，INH口服连续1～2年，随访中生长发育良好。结合文献对有关问题进行讨论。     

Fas/FasL、Bcl-2基因在急性阻塞性黄疸肝细胞中的表达及意义

目的研究Fas/FasL、Bcl-2基因在急性阻塞性黄疸肝细胞凋亡中的表达情况. 方法 SD大鼠30只,随机分为3组.A组为假手术组,B、C组为实验组,结扎胆总管,B组饲养7 d,C组饲养14 d.每组动物处置后观察肝细胞凋亡现象,检测肝细胞凋亡率和Fas、FasL、Bcl-2基因的表达情况.结果 (1)电镜观察到B、C组肝细胞有典型的凋亡现象.(2)各组间的肝细胞凋亡率比较有统计学意义(P<0.05).(3)各组大鼠肝细胞中Fas均有阳性表达,阳性率比较无显著差异(P＞0.05);各组FasL、Bcl-2阳性率有显著差异(P<0.05),C组高于B组.结论 (1)肝细胞凋亡率的升高是导致阻塞性黄疸肝损伤的一个重要机制.(2)Fas/FasL系统是阻塞性黄疸肝细胞凋亡的一个重要途径.(3)Bcl-2基因的表达是肝细胞抵制凋亡的一个重要表现.     

兔肾微血管内皮细胞的体外培养及鉴定方法

目的 探索肾微血管内皮细胞的体外培养方法，为骨组织工程再血管化提供理想的种子细胞；方法 采用三步梯度筛网法，先获得较高纯度的肾血管球，再应用肾血管球外植法体外培养肾微血管内皮细胞；并对肾微血管内皮细胞进行Ⅶ因子相关抗原免疫组化鉴定和透射电镜观察。结果 体外培养出纯度很高的血管内皮细胞并培养了10代；Ⅷ因子相关抗原免疫组化阳性，透射电镜检测出W-P小体。结论 该法可成功培养出肾微血管内皮细胞。     

髓内钉在矫治儿童成骨不全严重肢体畸形中的应用

[目的]探讨用髓内钉治疗儿童成骨不全严重肢体畸形中的矫形和防止再骨折的作用。[方法]2000年1月-2004年8月期间，共治疗8例，男3例，女5例。术中均将弯曲股骨或胫骨行多段截骨后髓内钉固定。其中2．0mm克氏针置入2例，Ender钉3例，Nancy弹性髓内钉3例。[结果]术后8例畸形改善明显，随访9个月．5a，平均2．4a，随访中肢体未再发骨折，未见髓内针合并感染、骨不连等并发症。1例术前轮椅患儿术后可扶拐行走；1例发生克氏针骨外部分断裂。[结论]多段截骨矫形后内置髓内钉治疗儿童成骨不全，对矫正肢体畸形、减少再次骨折机会，效果确实可靠。