microRNA与结核病相互关系的研究进展

microRNA（miRNA）是一类广泛存在于各种生物体内的小分子非编码单链RNA,主要在转录后水平调控靶基因的表达。越来越多的证据表明它在细胞分化与沟通、机体发育、免疫反应等诸多方面都发挥着重要作用。尤其在疾病相关研究中,miRNA更是具有广泛的用途和美好的前景。本文主要针对miRNA的相关特性、与结核病（tuberculosis,TB）相互关系的研究进展以及应用前景等做综述。     

胚胎干细胞与羊水干细胞

目前干细胞的再生潜能得到生物医学领域诸多学者的关注,胚胎干细胞再生潜能高但获取有悖于伦理,科学家转而研究其他成体干细胞,以利用其再生特性进行器官修复等。该文就羊水干细胞与胚胎干细胞的特性、比较及应用予以介绍。     

冬虫夏草及其混伪品的性状鉴别

对冬虫夏草及其混伪品作了鉴别。指出:混淆品有霍克斯虫草、蛹草、凉山虫草、新疆虫草、分枝虫草、炒木五;伪品有地蚕、草蚕、石蚕、白僵蚕、甘遂、人工伪制虫草等。认为确保用药安全有效,保证其康复保健的疗效,应提高鉴别冬虫夏草的能力。     

浅析医院药剂科管理

为了适应国家医疗体制改革,加强医院药局管理水平,保障患者用药安全、合理、经济、有效,为患者提供优质的药学服务。本文就健全管理制度、严格药品管理、强化服务质量、科学化管理等方面展开分析,提出自己的见解及建议,旨在通过良好的药局服务形象和业务水平来增强医院整体竞争力。     

EV71病毒反向遗传学系统的建立及拯救病毒的鉴定

目的：建立高效的EV71病毒反向遗传学系统,快速获得拯救病毒并鉴定其活性。方法：首先构建含有人RNA聚合酶Ⅰ启动子（Ppol Ⅰ）、ccdB自杀基因和鼠终止子（mTer）的接收质粒pHM-ccdB,并在ccdB两侧引入AarⅠ酶切位点;为了回避EV71病毒基因组中自身的AarⅠ酶切位点,分两段PCR扩增基因组,在引物中引入必需的AarⅠ酶切位点,通过Golden Gate Clone技术连接到目的载体中获得病毒拯救质粒pHT-EV71,转染至RD细胞后,获得拯救的EV71病毒,并以RT-PCR、病毒滴度、Western blot以及电镜检测等方法鉴定拯救子代病毒。结果：通过引入ccdB致死基因和Golden Gate Clone成功构建了EV71病毒的拯救质粒（pHT-EV71）,并将其转染至RD细胞后,观察到明显的致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）,将得到的拯救子代病毒,经EV71 VP1的特异性引物进行RT-PCR扩增,观察到长约1 900 bp的特异性条带;Western blot结果显示,该病毒可与EV71 VP1特异抗体结合;透射电子显微镜（transmission electron microscopy,TEM）检测可见20～30 nm球形病毒颗粒;在RD细胞中将子代病毒连续增殖8代后,检测其毒力高于母本株（6.35 lgTCID50/mL）。结论：通过引入ccdB和Golden Gate Clone技术,建立了快速、高效构建EV71病毒的拯救质粒的方法,效率达到100%,为正链RNA病毒反向遗传学系统的构建提供了一种新的策略,为进一步研究EV71病毒的致病机制及疫苗制备等提供了技术平台。     

Sigma E基因对耻垢分枝杆菌五种药物敏感性的影响及机制研究

目的 探讨Sigma E (sigma factor E,SigE)基因影响耻垢分枝杆菌对5种药物的敏感性及其作用机制研究。方法 PCR法扩增出耻垢分枝杆菌sigE基因,克隆入质粒pMV261构建重组pMV261-SigE质粒,测序验证。重组质粒电转入耻垢分枝杆菌,Western blot检测SigE的表达。设立含空质粒转化菌为对照组,采用刃天青作为指示剂的微量滴定板法和菌落计数法检测pMV261-SigE重组耻垢分枝杆菌对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、左氧氟沙星和环丙沙星5种抗结核药物的敏感性。采用相应抗生素处理重组耻垢分枝杆菌48 h诱导细菌进入非复制持留状态,随后在含20 ng/mL的结核分枝杆菌复苏促进因子E (resuscitation-promoting factor E, RpfE)的7H9中静置培养2周,计数最大可能数和细菌生长数,测算复苏指数来了解SigE对药物敏感性的影响机制。结果 成功构建pMV261-SigE,经测序鉴定序列正确,Western blot检测到SigE在耻垢分枝杆菌中表达。与对照组相比,表达SigE重组耻垢分枝杆菌组对异烟肼、利福平等5种药物的相对荧光百分比高,敏感性下降。5组抗生素中,异烟肼、乙胺丁醇两种药物作用后pMV261-SigE重组耻垢分枝杆菌复苏指数明显高于对照组。结论 SigE可通过促进耻垢分枝杆菌进入持留状态影响异烟肼和乙胺丁醇作用的敏感性。     

RseA基因影响耻垢分枝杆菌药物敏感性的生物信息学分析与初步验证

目的 筛选RseA在耻垢分枝杆菌中可能调控药物敏感性的基因或通路,并进行初步验证。方法 利用分子克隆技术构建RseA基因过表达耻垢分枝杆菌组和空质粒对照组;利用转录组测序技术和生物信息学方法筛选2组细菌间的差异表达基因(DEGs),分析其基因本体论(GO)及京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集情况;并构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络。利用结核分枝杆菌复苏促进因子E(RpfE)促使非复制持留菌复苏,测定复苏指数(RI)对筛选出的关键靶向基因或通路进行初步验证。结果 RseA基因过表达后,筛选出2 403个DEGs,其中2 335个表达上调,68个表达下调。GO分析结果表明,DEGs主要参与氮化合物代谢过程的调控、RNA代谢过程的调控、转录因子活性和序列特异性DNA结合过程调控等。KEGG分析结果显示,DEGs主要参与萜类骨架的生物合成、果糖和甘露糖代谢和同源重组等通路。从PPI网络MCODE模块中筛选出前8个hub基因rpsG、rplM、rpsO、rpsT、rpmH、rplS、rpsJ、rplT,并从这些基因的分析结果得知,其主要参与了核糖体通路。使用RpfE促进复苏后,RseA组复苏指数明显低于对照组。 RseA调控了多个靶向基因,参与核糖体的结构组成和核糖体通路,增强耻垢分枝杆菌对抗结核药物的敏感性,为进一步的机制研究奠定了基础。     

锌离子依赖的金属蛋白酶-1体内抑制分枝杆菌的抗原处理

目的：在小鼠体内观察卡介苗的锌离子依赖的金属蛋白酶-1（Zinc metalloprotease-1,Zmp1）对结核分枝杆菌抗原PPE68处理的影响。方法：6～8周龄BALB/c小鼠随机分为5组,分别为pBudCE4.1空质粒对照组（n=7）、表达PPE68抗原肽的pBud－CE4.1-PPE68p质粒组（n=9）、表达PPE68抗原的pBudCE4.1-PPE68质粒组（n=9）、PPE68抗原和Zmp1共表达的pBudCE4.1-PPE68-Zmp1质粒组（n=10）及PPE68抗原肽和Zmp1共表达的pBudCE4.1-PPE68p-Zmp1质粒组（n=8）。各组质粒电转化减毒沙门菌株SL7207构建相应的重组沙门菌。以灌胃方式将各组沙门菌免疫小鼠3周。收集小鼠血液和肺肠灌洗液,采用ELISA法测定血清中IFN-γ、IL-12含量及肺与肠道sIgA的含量;分离培养脾细胞,用CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖情况。结果：与PPE68抗原组相比,PPE68和Zmp1共表达组的IFN-γ（117.29±16.86,P=0.034）、IL-12（40.46±7.11,P=0.0037）、淋巴细胞刺激指数SI（3.30±0.49,P=0.004）均降低;与PPE68抗原肽组相比,PPE68抗原肽和Zmp1共表达组相应因子含量下降不明显,IFN-γ（132.75±28.40,P=0.070）、IL-12（55.43±11.78,P=0.198）、SI（4.70±1.57,P=0.124）。结论：卡介苗的Zmp1影响结核分枝杆菌抗原PPE68的处理过程,这可能是影响BCG免疫效果的重要原因。     

利用CRISPR/Cas9系统检测同源片段长度对重组效率的影响

目的：在大肠埃希菌中利用CRISPR/Cas9系统对插入失活的mCherry红色荧光报告基因进行靶向切割并重组,以研究同源片段长度对重组修复效率的影响。方法：通过Golden Gate克隆方法构建Cas9表达质粒pKD46-Cas,转化至大肠埃希菌DH5α中,阿拉伯糖诱导表达Cas9蛋白,Western blot检测蛋白表达。用同样的方法,将一段随机靶标序列引入pTac-mCherry-3guid质粒中,造成插入失活,同时在插入序列两侧分别预留0、40、80、120 bp的mCherry编码区overlap序列,构建出含不同长度同源片段的插入失活mCherry荧光报告质粒pQ0、pQ40、pQ80、pQ120,并将其分别转化到表达Cas9蛋白的大肠埃希菌DH5α中,对应的细菌平板分别为pQ0组、pQ40组、pQ80组及pQ120组,每组各9个平板,对每个平板的红、白色菌落进行计数,分别计算出红色菌落数/菌落总数的比值,即为重组修复效率。结果：PCR及测序证实pKD46-Cas质粒及插入失活的mCherry荧光报告载体pQ0、pQ40、pQ80、pQ120构建成功,Western blot鉴定pKD46-Cas在大肠埃希菌DH5α中表达Cas9蛋白;红色菌落计数显示pQ0组为0,其余3组均出现红色菌落,4组重组修复效率的差异有统计学意义（P<0.05）,重组修复效率与同源片段长度呈正相关（r=0.792,P<0.01）。结论：成功建立了基于mCherry红色荧光报告基因和Cas9的同源重组效率检测系统;研究表明不包含同源片段的质粒无法进行有效的重组,当同源片段在0~120 bp时其长度对重组效率有影响。此系统为深入研究原核生物的同源重组提供了一个新的技术平台。     

重庆市耐多药肺结核可疑患者药敏结果分析

目的：通过分析重庆市耐多药肺结核（multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB）可疑患者药敏结果,为重庆市耐多药结核病的发现及控制提供参考和依据。方法：2014年7月至2016年2月重庆市39个区县573例MDR-TB可疑患者痰培养阳性分离株,采用比例法进行4种一线抗结核药物和6种二线抗结核药物的药敏试验,对药敏结果进行统计分析。结果：573例MDR-TB可疑患者的MDR-TB检出率为25.0%,明显高于单耐药结核病（single drug-resistant tuberculosis,SDR-TB）检出率（9.6%）及多耐药结核病（poly drug-resistant tuberculosis,PDR-TB）检出率（8.0%）（P<0.001）。高危人群MDR-TB检出率为26.6%（130/488）,明显高于新患者的15.3%（13/85）（P=0.026）。高危人群中,复治失败患者MDR-TB检出率最高,为42.1%（16/38）,其次为初治失败患者,为40.0%（18/45）。结论：重庆市耐多药肺结核可疑患者MDR-TB检出率高,耐多药肺结核防控形势严峻。高危人群尤其是复治失败和初治失败患者应该作为耐多药肺结核筛查的重点人群。