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目的 基于重叠延伸PCR（SOE PCR）技术构建转录因子EB（TFEB）丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化。 方法 根据SOE PCR技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R及突变引物Fn和Rn进行第1步PCR扩增,获得含突变位点的产物1和产物2。经第2步PCR退火延伸对产物1和产物2进行重叠拼接,以拼接后DNA片段为模板,采用外侧引物F和R进行第3步PCR扩增获得含突变位点的目的DNA;将其克隆至pGEX-6p-1载体,采用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ进行酶切鉴定,DNA测序验证突变结果。于大肠杆菌（E.coli）中分别采用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）在不同条件下诱导TFEB及其突变体重组蛋白表达。Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝珠分离纯化蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化产物蛋白浓度和相对分子质量。 结果 第1步PCR扩增获得均含有突变位点的2条DNA片段,经第2步PCR退火延伸和第3步PCR扩增后获得大量含有突变位点的完整DNA片段。双酶切鉴定,连接的DNA片段与目的片段大小一致。DNA测序显示TFEB的114位丝氨酸（TCT）成功突变为丙氨酸（GCT）。在0.5?mmol·L－1 IPTG、16?℃诱导过夜条件下获得TFEB及其突变体的可溶性蛋白表达。SDS-PAGE凝胶电泳,纯化后蛋白浓度较高,分子大小正确。 结论 利用SOE PCR技术成功实现了TFEB丝氨酸114位点的定点突变,并且TFEB及其突变体基因在E.coli中成功表达。 相似文献
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目的探讨超声在高血脂患者颈动脉检查中的应用价值。方法选取2015年10月至2017年3月收治的64例高血脂患者与64名健康体检者的颈动脉超声诊断进行对照分析;试验组纳入64例高血脂患者,对照组纳入64名健康体检者。对两组临床治疗前后颈动脉超声改变进行对照研究。结果试验组颈动脉内中膜厚度(IMT)增厚阳性率及斑块阳性率明显高于对照组(P<0.05);临床治疗后两组IMT明显减小(P<0.05)。结论超声在高血脂患者的颈动脉检查中有较高的阳性检出率,对颈动脉粥样硬化患者的临床用药有较高的指导价值。 相似文献
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1临床资料孕妇,29岁,孕3产1活1,2004年产一子体健,2008年人流1次,此次是患者第三次妊娠,既往体健,无家族史及个人病史,无近亲结婚史。孕30+6W行常规超声检查。超声显示:胎儿头位,双顶径约7.4cm,胎儿双唇肥厚,呈"鱼嘴"样改变。未见明显鼻骨及鼻翼,可见鼻孔。胎儿双眼外侧可见异常不均匀中等回 相似文献
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