外泌体在骨再生中的应用研究进展

骨组织损伤后需要恢复原形态及功能，然而目前常用的骨移植方法因存在供体来源、并发症等问题而受到限制，因此需要寻求新的骨再生策略。近年研究表明外泌体可通过转运miRNA、蛋白质等生物活性分子，调控受体细胞的分化、增殖和分化功能，可成为促进骨再生的潜在治疗载体。本文将系统综述外泌体的性质及其在骨再生中的作用，为其在骨再生中的进一步应用提供理论依据。     

ADAM28基因原核表达载体的构建和在大肠杆菌中的融合表达

目的:利用消减杂交技术克隆出牙齿发育相关基因ADAM28。方法:本研究为构建ADAM28基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导其表达并纯化出ADAM28蛋白;采用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增出ADAM28基因的蛋白编码序列,克隆到中间载体pMD18-TVector中产生pMD18-T-ADAM28,再经双酶切得到ADAM28片段定向克隆到pGEX-4T-1载体中,构建融合表达载体pGEX-4T-ADAM28;在大肠杆菌中利用IPTG进行诱导表达,得到GST-ADAM28融合蛋白,并经SDS-PAGE电泳初步纯化。结果:①成功构建融合表达载体pGEX-4T-ADAM28,并经酶切鉴定、PCR鉴定和测序验证显示插入的ADAM28序列正确,阅读框架完整,未发现突变。②得到初步纯化的GST-ADAM28融合蛋白。经IPTG诱导后出现一条约35.3×103的新蛋白带。结论:ADAM28基因编码蛋白质能够在原核细胞中表达并纯化,为进一步研究该蛋白质的功能打下基础。     

转染BMP-II型突变受体基因对Tca8113舌癌细胞增殖的影响

目的：明确转染BMP-Ⅱ型突变受体对Tca8113舌癌细胞的作用，以进一步探讨BMPs对口腔上皮恶变的作用机制。方法：用FuGENll6(Transfection Reagent Kit)真核转染试剂盒将携带BMP-Ⅱ型突变受体cDNA的真核表达载体转染Tca8113细胞(命名为Tca8113ZR细胞)；然后对Tca8113ZR和Tca8113细胞分别进行生长曲线、MTT检测，FCM分析，BrdU标记检测细胞的增殖活性及DNA合成；以观察转染前后舌癌细胞生物学性状的变化。结果：Tca8113ZR细胞和Tca8113细胞相比，形态未见明显变化，但是细胞的增殖活力明显下降。结论：BMPs信号表达水平的改变在口腔上皮组织的恶变过程中起着十分重要的调控作用。     

mcpr1基因的真核表达载体的构建与鉴定

目的 :构建腭裂相关基因mcpr1与pcDNA3 .1/V5 HisB融合的高效真核表达载体 ,为研究mcpr1基因的功能奠定基础。方法 :根据mcpr1基因的核苷酸序列 ,设计并合成引物 ,通过PCR方法 ,从包含有mcpr1基因全长的克隆载体T easy/mcpr1中 ,扩增出该基因外显子片段 ,将扩增产物连接到真核表达载体pcDNA3 .1/V5 HisB中。对该重组体进行PCR和酶切鉴定 ,以及测序验证。结果 :以重组体为模板扩增出40 0bp左右的特异性基因片段 ,与mcpr1基因片段大小一致 ,酶切鉴定也显示有 40 0bp左右的基因片断。测序结果显示与已知基因序列一致。结论 :成功构建mcpr1基因的真核表达载体 ,为下一步研究mcpr1基因的功能奠定了基础。     

牙齿发育相关基因adam28多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备及鉴定抗ADAM28的多克隆抗体。方法采用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增出adam28基因的蛋白编码区序列,克隆到中间载体pMD18-T Vector中,再经双酶切得到adam28片段定向克隆到pGEX-4T-1载体中,构建融合表达载体pGEX-4T-adam28,在大肠杆菌中用IPTG进行诱导表达,得到GST-ADAM28融合蛋白,经过初步纯化及SDS-PAGE电泳,在35300的新蛋白带处直接割胶,作为抗原免疫新西兰大白兔后获取抗体。结果成功构建融合表达载体pGEX-4T-adam28,得到初步纯化的GST-ADAM28融合蛋白,免疫兔子1个月后,获得免疫血清,盐析法纯化得到多克隆抗体。Western印迹结果显示所得到的抗体具有较高的特异性,ELISA分析证实其效价可达1∶16000。结论成功制备出高效价的抗ADAM28多克隆抗体,为进一步研究ADAM28在牙齿发育中的作用和表达分布奠定基础。     

大鼠切牙颈环结构成牙能力的实验研究

目的:观察大鼠切牙颈环结构种植于鼠肾被膜下形成牙齿样结构的能力。方法:取出生后3~4d的SD仔鼠切牙,将切取的颈环结构种植到母鼠肾被膜下,建立组织工程牙齿的体内培养模型。2~4周后取材,常规固定,HE染色观察。结果:下切牙颈环结构在体内形成了包含釉质和牙本质牙髓复合体的牙齿样结构,上切牙颈环结构仅形成了牙本质牙髓复合体的牙齿样结构。结论:大鼠切牙颈环结构在体内能够形成牙齿样结构,其中颈环中的上皮干细胞起着重要的作用。大鼠肾被膜下种植可以做为体内组织工程化牙齿样结构构建的立体培养模式。     

牙胚细胞条件培养液诱导大鼠胚胎面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化

目的：探讨牙胚细胞条件培养液（TGC—CM）在诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中的作用。方法：取妊娠12．5d SD大鼠胎鼠第4代下颌突外胚间充质细胞，在牙胚细胞条件培养液（TGC—CM）的诱导下，通过形态学观察、免疫组化、RT—PCR等方法，探索牙胚细胞条件培养液诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的可能。结果：面突外胚间充质细胞在诱导培养基中生长良好。培养7d，在诱导组中细胞出现核极化，有很长的突起，细胞平行排列。抗牙本质涎蛋白（DSP）呈阳性反应。RT—PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白（DSPP）和牙本质基质蛋白-1（DMP-1）。结论：面突外胚间充质细胞在含有多种细胞因子的TGC—CM的作用下能分化为成牙本质样细胞，能为研究牙齿的分化和发育提供良好的模型和实验依据。     

成纤维细胞上清提取物对表皮细胞增殖迁移的影响

目的:在人皮肤成纤维细胞培养上清液中寻找有效的生长因子样活性组分.方法:收集超滤成纤维细胞的培养上清液,采用MTT法、划痕试验检测对人皮肤表皮细胞增殖和诱导迁移的影响.结果:上清液中分子量5～10 KD组和5～30 KD组的试验组对表皮细胞有明显促增殖趋势,而5～30 KD组有较强的促进单层细胞伤口愈合的能力,二者与对照组比较有显著性差异(P＜0.01).结论:人成纤维细胞培养上清液的提取物中含有促进表皮细胞增殖及迁移能力的活性物质,可以尝试用其替代部分条件培养基进行对组织工程皮肤种子细胞的实验研究.     

牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化过程中基因表达研究

目的：分离培养来源于人成体牙髓组织的干细胞(dental pulp stem cells，DPSC)，分析研究其在未分化状态及在矿化诱导液中基因表型的变化：方法：采用胶原酶消化法获得人牙髓组织的单细胞悬液，14 d后挑取细胞克隆，分别在普通培养基和矿化诱导培养基中进行培养，利用RT-PCR，图像分析检测细胞基因表型变化。结果。未诱导的DPSC不表达牙本质特异性蛋白(dentin phosphprotein,DSPP)及骨涎蛋白(Bone sialoprotein，BSP)，表达部分成骨(osteocalcin,OCN alkaline phsphatase,ALP)相关表型，低表达转录因子核心结合因子(Cbfa-1)；与末诱导的DPSCs相比较，在成骨诱导中DPSCs表达DSPP和BSP，骨相关基因表达也相应上调。结论：DPsCs在矿化诱导液的作用下向成牙本质样细胞分化，其过程有可能是通过谱系特异表犁的表达或表达上调实现的。     

用形态定量学方法研究颊粘膜上皮棘层细胞在良、恶性病变中的变化

对口腔颊部粘膜在正常、炎症、纤维增生、乳头状瘤、癌旁上皮及鳞癌癌巢的状态下的上皮棘层细胞及胞核的面积、体积和胞核的直径、形态进行了检测分析,结果提示反映细胞和胞核大小的形态学指标对于判断病变的程度有着重要的意义。