真核表达质粒pBABE-hygro-PLAP-1的构建及鉴定

目的:构建并鉴定含有plap-1基因和已知FLAG序列的真核细胞表达载体pBABE-hygro-PLAP-1.方法:采用PCR扩增PLAP-1的目的片段,然后连接到已知FLAG序列的载体p3×FLAG-CMV-10上:再次通过PCR扩增出PLAP-1的目的片段及已知序列的FLAG,最后将其插入真核细胞表达载体pBABE-hygro的多克隆位点上.对该重组体进行酶切鉴定和测序验证.结果:通过对重组质粒进行酶切鉴定以及DNA序列测定分析.证明真核表达载体pBABE-hygro-PLAP-1构建成功.结论:成功构建php-1基因的真核表达载体,为进一步研究plap-1基因的功能奠定了实验基础.     

人骨形态发生蛋白-2基因克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人骨形态发生蛋白- 2（hBMP2）基因片段,构建pcDNA3.1- hBMP2真核表达质粒。方法采用逆转录聚合酶链式反应（RT- PCR）技术,从人骨肉瘤中扩增出人骨形态发生蛋白- 2基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3.1真核表达载体上,构建pcDNA3.1- hBMP2重组质粒,通过用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。结果经PCR扩增、酶切电泳分析和DNA测序证实,本实验构建的重组质粒目的基因片段为人BMP2- cDNA。结论本实验成功克隆了hBMP2基因并构建成其真核表达质粒。     

癌胚抗原基因真核表达载体的构建

目的：克隆人癌胚抗原（CEA）基因cDNA,构建pcDNA3．1-CEA真核表达载体。方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术,从人结肠癌细胞组织克隆出CEA基因片段,通过基因重组技术将该基因片段重组于pcD—NA3．1真核表达载体上,构建成pcDNA3．1-CEA重组质粒,分别用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。结果：经PCR扩增,发现2.1kb的目的基因条带、双酶切电泳分析可见2．1kb的目的基因条带和5．4kb的载体条带、单酶切电泳分析可见0．9kb的条带和6．6kb的条带、DNA测序证实载体中的目的基因序列与CEA的cDNA序列完全相同。结论：本实验成功地克隆了CEA基因并构建了其真核表达质粒,为进一步研究CEA真核表达载体抗肿瘤的实验打下基础。     

纤维粘连蛋白片段真核表达载体pcDNA3．1（＋）-EDA的构建

目的构建纤维粘连蛋白（fibronectin，FN）基因的EDA外显子的真核表达载体，以研究EDA对涎腺腺样囊性癌（slivary adenoid cystic carcinoma，SACC）生物学行为的影响。方法以RT-PCR技术从口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma）细胞株KB中扩增出外显子EDA，克隆人pcDNA3．1（＋）真核表达载体，用PCR和限制性内切酶酶切、DNA测序鉴定真核表达载体pcDNA3．1（＋）-EDA。结果PCR、酶切、DNA测序鉴定证明成功构建了pcDNA3．1（＋）-EDA真核表达载体，DNA测序显示重组质粒含有与EDA片段基因序列完全相等的基因。结论成功构建了纤维粘连蛋白（fibronectin，Fn）基因的EDA外显子的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-EDA。     

hrCEMP1真核表达载体的构建及其在成纤维细胞株中的表达

目的：构建含hrCEMP-1基因真核表达质粒。方法：采用PCR方法扩增hrCEMP1基因,并在两端添加合适的酶切位点;利用定向克隆技术将hrCEMP1基因插入到载体pcDNA3.1中,重组的pcDNA3.1-CEMP1在大肠杆菌DH5α内扩增后,通过酶切电泳鉴定和DNA测序证明质粒构建成功;利用高效率的阳离子聚合物,将经过鉴定的pcDNA3.1-CEMP1转染入NIH3T3细胞中,并以RT-PCR检测hrCEMP1基因的转录。结果：通过对重组质粒pcDNA3.1-CEMP1进行酶切鉴定以及DNA序列测定分析,证明真核表达重组质粒pcDNA3.1-CEMP1构建成功,开放阅读框架正确;转染细胞株的RT-PCR结果中观察到特异性242bp片段。结论：成功构建含hrCEMP-1基因真核表达质粒pcDNA3.1-CEMP1,并可在NIH3T3细胞株中mRNA水平表达。     

mcpr1基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 :构建mcpr1基因原核表达载体 ,表达MCPR1蛋白。 方法 :采用多聚酶链式反应 (PCR)扩增出mcpr1基因的蛋白编码序列 ,克隆到中间载体中 ,再经双酶切 ,亚克隆到表达载体中 ,构建该基因的融合表达载体pGEX 4T mcpr1,在大肠杆菌中用IPTG诱导表达 ,SDS PAGE电泳。 结果 :酶切和测序鉴定 ,表明融合表达载体内插入片段正确 ,在大肠杆菌中诱导后 ,出现一条 3 60 0 0的新蛋白带 ,主要存在于细菌沉淀中 ,占总蛋白的3 9 %。结论 :研究表明mcpr1基因编码的蛋白质能够在原核细胞中表达 ,为进一步深入研究该蛋白质的结构与功能打下基础     

人可溶性白介素-1受体真核表达载体pcDNA3/sIL-1R的构建

目的　本研究旨在构建人可溶性白介素-1受体(sIL-1R)真核表达载体pcDNA3/sIL-1R,为研究骨关节病的基因治疗奠定实验基础。方法　将人sIL-1R基因的RT-PCR纯化产物及质粒pcDNA3·1(+) DNA经KpnI和 XhoI双酶切、胶回收纯化酶切片段后,体外连接酶切片段,使其定向重组,再将重组DNA转化E.coliCompetent Cells JM109,经复苏后,在含Ampr的LB固体培养基上筛选出阳性克隆。结果　挑取的LB固体培养基上的6个单菌落经酶切及测序鉴定,证实均为阳性克隆,即sIL-1R与pcDNA3·1(+)体外重组成功。结论　采用体外重组技术,成功地将人sIL-1R cDNA插入了真核表达载体pcDNA3·1(+)中。     

伴放线放线杆菌菌毛融合蛋白基因的克隆

目的　探讨克隆伴放线放线杆菌菌毛融合蛋白基因ltb-fap的方法。方法　采用PCR方法扩增伴放线放线杆菌菌毛相关蛋白(Fap)和大肠杆菌不耐热性肠毒素B亚单位(Ltb)的融合蛋白基因ltb-fap,NcoⅠ/EcoRⅠ双酶切载体pET28a(+)及ltb-fap基因,连接形成重组质粒pETltb-fap,转化至大肠杆菌DH5α,扩增后提取质粒pETltb-fap进行PCR鉴定、酶切鉴定和序列分析。结果　本实验扩增的ltb基因约为303 bp,fap基因约为228 bp,融合基因约为 531 bp。重组质粒含外源基因片段约为531 bp,酶切鉴定可得到一条约531 bp带,DNA测序结果表明与GenBank中的fap基因序列有97·4%的同源性。结论　成功克隆出融合蛋白基因ltb-fap,为进一步进行蛋白表达、制备抗体奠定基础。     

变形链球菌葡糖基转移酶真核表达质粒pcDNA3-gtfB的构建

目的:构建变形链球菌葡糖基转移酶真核表达质粒pcDNA3-gtfB,为以其作为基因疫苗进行免疫动物实验奠定物质基础。方法:以变形链球菌GS-5全染色体DNA为模板,通过PCR方法扩增获得含有多个编码变形链球菌葡糖基转移酶抗原表位的目的基因gtfB,将分离纯化的目的基因和质粒pcDNA3用KpnÑ、XhoÑ双酶切,酶切产物在 T4 DNA连接酶作用下进行体外重组,用改良Hanahan法转化感受态大肠杆菌JM109,采用氨苄青霉素抗性LB平板初步筛选阳性克隆子后,抽提重组质粒,进行酶切鉴定,DNA序列测定。结果:经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计相同,并定向插入真核表达载体pcDNA3,插入相位正确,未改变目的基因的阅读框架。结论:真核表达质粒 pcDNA3-gtfB含有多个葡糖基转移酶免疫显性抗原表位编码基因,且选用的高表达真核表达载体pcDNA3,能直接激活抗原提呈细胞,可以使重组质粒pcDNA3-gtfB具有较强的免疫原性和免疫反应性,为利用其作为基因疫苗防龋奠定了基础。     

骨形成蛋白-2基因克隆及真核表达重组子的构建

目的探讨人骨形成蛋白-2（BMP-2）全长基因的克隆，及其真核表达重组子构建方法。方法采用Trizol法从人髁状突骨组织中提取制备总RNA，利用逆转录技术转录出BMP-2 cDNA，以其为模版，PCR扩增出BMP-2全长基因，与真核表达载体pcDNA3．1（＋）连接．构建真核表达重组子pcDNA3．1（＋）／BMP-2．经酶切和序列分析鉴定重组子的构建情况。结果PCR扩增产物在1200000处有扩增条带．与目的基因大小相符．重组质粒经限制性内切酶Hind Ⅲ和XbaⅠ双酶切后。得到5400000和1200000的BMP-2条带，BMP-2基因已成功克隆且成功与pcDNA3．1（＋）连接。结论成功克隆出人BMP-2基因，并构建其真核表达重组子pcDNA3．1／BMP-2，为进一步研究BMP-2的功能、BMP-2基因在骨髓间充质细胞（hMSCs）中表达以及在骨组织工程中的应用研究奠定了基础．     

促凋亡分子Bad真核表达载体构建及其在人基底细胞癌细胞中的表达

目的:克隆Bcl-2相关促凋亡基因Bad的全长编码序列,构建Bad基因的真核表达载体并在人基底细胞癌细胞系(A431)中表达,为研究该基因在人基底细胞癌治疗中的作用奠定基础。方法:根据已发表的Bad基因的核苷酸序列设计并合成引物,用Hela细胞抽提的RNA进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用XhoI和EcoRI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1-myc中,用限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA3.1-myc-Bad并对其DNA测定序列。用脂质体法将pcDNA3.1-myc-Bad导入人基底细胞癌细胞系A431中,G418选择培养,Western blot及SABC-FITC分析鉴定其表达。瞬时转染A431细胞,通过细胞计数和集落形成实验观察其对A431细胞生长的影响。结果:RT-PCR扩增出长500bp的特异性片段,经克隆至pcDNA3.1-myc后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致。pcDNA3.1-myc-Bad在A431细胞中有表达并可影响细胞生长,与对照组有明显差异。结论:成功克隆了Bad的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pcDNA3.1-myc-Bad,并在瞬时转染肿瘤细胞后观察到细胞生长受抑制。     

通过T-A克隆技术构建含免疫刺激序列CpG基序的抗SBR DNA疫苗

目的:构建含免疫刺激序列、能够阻止变形链球菌在牙面粘附的防龋DNA疫苗.方法:根据原核表达质粒pSBR-CTA2B基因序列,设计针对编码变形链球菌表面蛋白抗原AgⅠ/Ⅱ分子中唾液蛋白结合区段(SBR)的特异性PCR引物,利用PCR技术由质粒pSBR-CTA2B扩增目的DNA片断;通过T-A克隆技术将目的DNA片段克隆于中间载体pMD18-T,鉴定插入方向后,选择插入方向正确的克隆,将目的DNA从中间载体释放,再克隆至含有CpG免疫刺激序列的真核表达载体pcDNA3.1.结果:通过对重组质粒pcDNA3.1-SBR进行酶切图谱分析和DNA序列测定分析,证明真核表达重组质粒pcDNA3.1-SBR构建成功、开放阅读框架正确.结论:利用T-A克隆等技术可成功将编码SBR的DNA片段克隆到含有免疫刺激序列CpG的真核表达载体pcDNA3.1的适当部位,构建出真核表达重组质粒pcDNA 3.1-SBR作为有效防龋的DNA疫苗.     

通过真核细胞表达系统获得重组人釉原蛋白

目的构建重组人釉原蛋白基因的真核表达系统，并建立稳定表达该蛋白的细胞系。方法取26周龄引产胎儿的牙胚组织，提取总RNA，用RT—PCR技术扩增釉原蛋白基因片段，插入中间表达载体pGEM -T。经双酶切后，再与真核表达载体pcDNA3.1^TM／myc—His（-）B相连接，构成最终的表达质粒，将该重组表达质粒转染至HEK 293A细胞，用G418筛选出阳性细胞克隆，并建立稳定表达釉原蛋白的细胞系。结果通过测序表明，人釉原蛋白基因被成功地连接到了真核表达载体上。将该表达系统转染HEK293A细胞后，进行Western Blot检测，证明有相对分子质量约32000的釉原蛋白表达。结论本实验成功构建了重组人釉原蛋白真核表达系统，建立了稳定细胞系，为获得高纯度的釉蛋白，进一步研究蛋白质功能奠定了基础。     

牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K基因真核表达载体的构建和体外表达

目的：构建牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K基因的真核表达载体，并检测其在体外真核细胞中的表达情况。方法：利用基因重组技术构建牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K基因重组质粒pcDNA3.1( )-KGPcd，然后通过脂质体将pcDNA3.1( )-KGPcd瞬时转染COS7细胞，以RT-PcR和间接免疫荧光法检测重组质粒的转录水平和蛋白表达情况。结果：成功构建了牙龈蛋白酶K真核表达载体；转染的COS7细胞中可检测到目的蛋白的转录和表达。结论：成功构建了pcDNA3.1( )－KGPcd真核表达载体并在哺乳动物细胞中能够正确转录和表达，为下一步作为基因疫苗免疫动物提供了依据。     

少汗型外胚层发育不良症eda-A1基因突变分析及其真核表达载体的构建

目的克隆少汗型外胚层发育不良症（HED）eda-A1基因并进行突变分析,同时构建eda-A1基因编码序列突变型（M）和野生型（W）的真核表达载体pcDNA3.1（-）-eda-A1-M/W,为进一步明析eda基因的功能奠定基础。方法设计含有BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点的引物, 从HED患者和正常人外周血淋巴细胞中提取总mRNA,利用RTPCR法克隆eda-A1（M/W）基因cDNA序列;并运用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pcDNA3.1（-）载体和eda-A1基因片段,将eda-A1 （M/W） 插入到pcDNA3.1 （-） 载体中,从而构建新的真核表达载体,命名为pcDNA3.1 （-）-eda-A1-M和pcDNA3.1（-）-eda-A1-W。结果成功克隆少汗型外胚层发育不良症eda-A1基因,并发现未见报道过的907位A→C错义突变,导致306位编码氨基酸由谷氨酰胺变异为脯氨酸;经PCR法、重组载体双酶切法、DNA测序验证,成功构建了pcDNA3.1（-）-eda-A1-W/M的真核表达载体。结论成功构建少汗型外胚层发育不良症eda-A1基因（突变型和野生型）真核表达载体pcDNA3.1（-）-eda-A1-M/W,为进一步研究该基因在牙齿发育中的生物学作用奠定了实验基础。     

含绿色荧光蛋白报告基因的TIMP-2真核表达载体的构建及其在人成釉细胞瘤中的表达

目的构建含有绿色荧光蛋白报告基因（GFP）的TIMP-2真核表达载体PcDNA3．1（＋）／GFP-TIMP-2，并探讨其在成釉细胞瘤（AB）中的表达情况。方法应用RT-PCR技术从体外培养的人AB中获得TIMP-2目的基因片段，采用分子克隆技术构建该基因的真核表达载体PcDNA3．1（＋）／GFP-TIMP-2，并以脂质体为介导转染至体外培养的人AB细胞。流式细胞仪测定转染效率，倒置相差荧光显微镜观察绿色荧光，RT-PCR检测转染前后TIMP-2mRNA的表达量的改变。结果构建的PcDNA3．1（＋）／GFP-TIMP-2经酶切和测序鉴定证明和预期结果一致。PcDNA3．1（＋）-TIMP-2转染人AM细胞后TIMP-2mRNA的表达量增加。结论成功构建TIMP-2真核表达载体PcDNA3．1（＋）／GFP-TIMP-2并转染至人AB细胞。