重组空肠弯曲菌PEB1蛋白的大量表达及其鉴定分析

目的 探讨基因工程菌PEB1 E.coli BL21(DE3)大量表达重组空肠弯曲菌PEB1蛋白的稳定性及其纯化方法并鉴定.方法 诱导培养工程菌E.coli BL21(DE3)表达重组空肠弯曲菌PEB1蛋白,经镍琼脂糖凝胶层析柱纯化,透析后通过SDS-PAGE分析纯化后的重组空肠弯曲菌PEB1蛋白分子量大小.结果 挑取的PEB1 E.coli BL21(DE3)单个菌落,经总共17 h的扩增,细菌总数可达1×1010以上.在咪唑浓度为100,200,300 mmol/L时,洗脱液中重组蛋白的含量较高,分子量在31KD左右.结论 基因工程菌PEB1 E.coli BL21(DE3)可大量稳定表达重组空肠弯曲菌PEB1蛋白,经鉴定与空肠弯曲菌外膜蛋白-PEB1蛋白分子量相同.     

RPL8基因修饰鼠树突状细胞的制备探讨

目的制备RPL8基因修饰的树突状细胞。方法无菌分离C57BL/6小鼠骨髓细胞,在细胞因子rmGM-CSF、rmIL-4、LPS的诱导下体外大量扩增培养DC细胞。并动态观察DC形态,流式细胞仪检测其表面标志。RPL8重组腺病毒以最佳的MOI感染鼠DC,并于感染后24h、48h、72h,荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白（EGFP）表达,应用RT-PCR方法检测DC中RPL8mRNA的表达情况。结果不同时相点,在荧光倒置显微镜下DC均有绿色荧光蛋白（EGFP）表达,DC细胞中有RPL8mRNA的表达,得到预期309bp的条带。结论成功制备RPL8基因修饰的树突状细胞,为进一步脑胶质瘤免疫基因治疗研究提供了基础。     

人IL-31基因克隆、表达及在皮肤炎症中的作用

目的 克隆人IL-31基因,构建原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌中表达,研究hIL-31蛋白与皮肤炎症的关系.方法 采用RT-PCR克隆人IL-31基因,将其克隆到原核表达载体pET28a( ),并通过IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中表达,用该目的蛋白刺激人表皮角质细胞HaCaT,RT-PCR检测趋化因子MIP-3β、TARC及TCA-3(I-309)mRNA的表达;小鼠皮内注射该目的蛋白,观察局部炎症表现,皮肤标本HE染色观察皮肤炎性特征,采血进行白细胞计数及分类,ELISA法检测血清IL-1βIL-6和TNF-α水平,流式细胞仪分析胸腺及脾脏T细胞亚群.结果 成功获得495bp的人IL-31基因,原核表达质粒构建正确,IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中大量表达;该目的蛋白可刺激HaCaT表达趋化因子MIP-3β、TARC、I-309;小鼠皮肤注射部位有脱毛,HE染色可见炎性细胞浸润,外周血白细胞总数增加,中性粒细胞比例增高,血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平增高,脾脏CD4 T细胞百分比增高,CD8 T细胞百分比减少.结论 人IL-31基因克隆及原核表达已获成功,hIL-31蛋白可刺激HaCaT细胞表达MIP-3β、TARC、I-309,诱导小鼠皮肤炎症反应.     

以CpG为佐剂的人IL-24多克隆抗体的制备

目的：采用在原核表达系统表达的人IL-24蛋白及人IL-24真核重组质粒免疫新西兰兔，制备兔抗人IL-24多克隆抗体。方法：利用IPTG诱导hIL-24在大肠杆菌中表达，纯化hIL-24重组蛋白，纯化后的蛋白经SDS—PAGE分析，同时提取hIL-24真核重组质粒，用以免疫新西兰兔，并以CpG为佐剂制备多克隆抗体。Western-blot鉴定抗体的特异性，ELISA法测定抗体效价。结果：人IL-24经IPTG诱导后可在大肠杆菌中大量表达，表达量占细菌总蛋白的30％，纯化后的蛋白纯度高；原核表达的重组蛋白和真核重组质粒免疫新西兰兔，通过抗体效价测定，获得了抗血清效价达1：640的多克隆抗体。结论：原核表达的hIL-24蛋白和hIL-24真核重组质粒均能刺激家兔产生抗体．其多克隆抗体的效价较高。     

空肠弯曲菌PEB1重组蛋白的表达及单克隆抗体的制备

目的表达CJPEB1重组蛋白,制备并鉴定CJ PEB1蛋白的单克隆抗体。方法诱导培养工程菌E．co-liBL21（DE3）表达CJPEB1重组蛋白,以PEB1蛋白溶液与等体积的佐剂完全乳化作为免疫原常规免疫BALB／C小鼠,制备单克隆抗体。无菌取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0进行融合,建立杂交瘤细胞株。将建株的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔诱生腹水制备抗体,应用间接ELISA法和双向琼脂扩散试验检测腹水中抗体的效价,应用Western-blot和玻片凝集试验检测抗体的特异性。结果得到高纯度的CJPEB1重组蛋白,蛋白质分子量大小与预计的理论值相符。获得两株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。两株杂交瘤细胞诱生的腹水,经间接ELISA法检测,腹水中的抗体效价分别为8×10^4和5×10^4,经双向琼脂扩散试验检测效价均为1：16。通过Westem-blot鉴定,两株杂交瘤细胞分泌的抗体均与PEB1蛋白特异性地结合;其诱生的腹水与CJ菌液混合出现凝集现象,而与大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌等菌液混合均未出现凝集现象。结论成功建立了两株稳定分泌抗CJPEB1重组蛋白抗体的杂交瘤细胞株并制备了抗CJPEB1蛋白的单克隆抗体,为今后研究多种检测CJ的方法创造了条件。     

负载核糖体蛋白L8的树突状细胞对黑色素瘤的抑制作用

背景与目的：研究发现核糖体蛋白L8(ribosomal protein L8,RPL8)在黑色素瘤中表达能激活黑色素瘤患者外周血单个核细胞增殖并产生白细胞介素2,提示RPL8可能参与抗肿瘤免疫应答,有望成为抗肿瘤治疗的靶点。本研究通过RPL8蛋白负载树突状细胞(dentritic cell,DC),探讨负载RPL8蛋白的DC对黑色素瘤的免疫效应。方法：原核表达RPL8蛋白,纯化后致敏小鼠骨髓来源DC,流式细胞仪检测DC表面标志,MTT法检测细胞毒性T淋巴细胞对小鼠黑色素瘤细胞的杀伤作用;负载RPL8蛋白DC免疫治疗小鼠后,观察肿瘤体积变化及小鼠生存时间。结果：纯化蛋白经蛋白质印迹法(Western blot)分析见约28×103大小的特异性条带;DC经RPL8及细菌脂多糖(Lipoplysaccharide,LPS)诱导成熟后细胞表面CD11c、CD80、MHC-Ⅰ类、MHC-Ⅱ类分子表达增高,能激活T淋巴细胞,对B16细胞有抑制作用,RPL8-DC组的抑制率在效靶比为30∶1时高达70%,较PBS组和DC组明显增高;负载RPL8蛋白DC免疫治疗小鼠后,肿瘤体积缩小,小鼠的生存期明显延长。结论：负载RPL8的DC对黑色素瘤有生长抑制作用。     

重组hIL-31抗体制备及其拮抗皮肤炎症的研究

目的:高效表达重组hIL-31制备IL-31抗体,探讨IL-31抗体拮抗皮肤炎症的作用,为研发IL-31抗体治疗性新药奠定基础.方法:①培养工程苗、IPTG诱导、菌体、超声破碎,用镍NTA柱纯化重组蛋白.②重组hIL-31蛋白溶液加佐剂免疫家兔,制备兔抗IL-31多克隆抗体.③将IL-31抗体分为3个剂量,经皮下注射和皮肤直接涂抹的途径,对已经致皮肤炎症的BALB/c小鼠治疗7d,治疗后3d取治疗部位皮肤作石蜡切片进行HE染色观察组织学变化,并检测血清中IL-6、IL-8、L选择素和MIP-3β等细胞因子的变化.结果:①SDS-PAGE电泳证实获得了高纯度的纯化人IL-31蛋白.②用重组hIL-31蛋白疫苗免疫家兔,在免疫后4周抗体滴度达到高峰,经ELISA法测血清抗体滴度为1:15 000～1:20 000,双扩滴度为1:16.Western blot结果重组IL-31蛋白能与抗IL-31抗体特异性结合.③小鼠皮肤组织切片HE染色显示,治疗组皮下和皮内均有炎症细胞浸润,呈现剂量依赖性趋势.④血清中炎性因子ELISA检测,涂抹组和注射组小鼠血清中IL-6、IL-8、MIP-3β均明显低于阴性对照组(P＜0.05).结论:①获得稳定表达的重组人IL-31蛋白,以此作为免疫原免疫家兔,诱导分泌高滴度的IL-31抗体.②IL-31抗体使皮肤炎症中炎性细胞减少,血清中炎症相关细胞因子明显降低.