帕金森病相关蛋白α-共核蛋白的可溶性表达、纯化及抗体制备

目的 利用分子克隆接术在愿核细胞中表达α-共核蛋白（SNCP），并制备免多克隆抗体。方法 从人神母经细胞SH-SY5Y细胞中提取总RNA，逆转录成cDNA。利用PCR技术扩增获得SNCP的cDNA序列，测序正确后克隆至pQE-30-GST表达载体上，在大肠埃希菌中表达GST-SNCP融合蛋白。融合蛋白纯化后免疫新西兰大白兔，制备特异性抗血清，并对该抗体进行检测。结果 琼脂糖凝胶电泳显示获得SNCP cD-NA序列为420bp。SDS-PAGE和Western blot分析，表达的融合蛋白呈可溶性，相对分子质量约为45000。以其为抗原制备的SNCP抗血清的ELISA效价达到1：32000，并且该抗体可与BALB/c小鼠脑组织中内源性SNCP发生特异性反应。结论 人SNCP可在原核细胞中可溶性表达。用表达的蛋白制备获得特异性较好的SNCP抗血清，为进一步了解SCNP的结构和功能以及在中枢神经系统退行性疾病的作用提供了必要的实验基础。     

CVB32A蛋白酶抑制帽样结构依赖的蛋白翻译

目的探讨CVB3的蛋白酶2A对真核细胞帽样蛋白翻译和内部核糖体进入位点（IRES）翻译机制的影响。方法构建表达载体pcDNA3．1—2A,将此表达载体分别与pEGFP—N1、pGL3（F-luc）以及pIRES-GFP载体共转染细胞后,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达,检测荧光素酶蛋白的表达。WesternBlot检测CVB3病毒和pcDNA3．1-2A对真核生物翻译起始因子4GI（eIF4GI）及多聚A尾结合蛋白（PABP）的影响。结果pcDNA3．1之A可以减少帽样依赖的GFP和荧光素酶蛋白的表达,但可以促进IRES依赖的GFP表达。CVB32A基因质粒转染和CVB3感染后,均可发现细胞内elF4G的切割现象;同时CVB3对PABP也有降解作用,而CVB32A基因转染对PABP无明显作用。结论CVB3的蛋白酶2A抑制真核细胞帽样途径蛋白翻译,促进IRES途径的翻译。     

短双链RNA对CVB3病毒细胞内清除作用的可行性研究及其机制探讨

目的 通过观察短双链RNA(Short interfering RNA,siRNA)体外转染HeLa细胞评价siRNA抗CVB3病毒感染的可行性和抑制作用机制.方法 通过细胞病变作用保护实验,选择合适的siRNA剂量.Western Blot、RT-PCR等方法在体外检测siRNA抗CVB3病毒复制作用及作用途径.结果siRNA-3753通过脂质体转染试剂能高效转入HeLa细胞,转染效率可达98.77%,在细胞内可稳定长达48 h.siRNA-3753的浓度为0.6 μmol/L对病毒抑制率高同时对细胞不会产生毒性作用,该浓度作为本次研究的实验剂量.siRNA-3753抗CVB3病毒感染作用是通过siRNA直接降解病毒基因得到的,而不是通过激活PKR或干扰素等其他未知因素起效的.结论 siRNA可以高效、较长时间的转染入HeLa细胞内,在低剂量时即产生较好的抗病毒感染作用,通过直接降解病毒基因组的途径特异性抑制CVB3病毒的复制及感染.     

一种新型原核表达载体的构建及应用

目的 利用基因重组技术构建一种新型原核表达载体，使之表达带有His和GST标签的融合蛋白。方法 以质粒pGEX为模板，将PCR扩增出的GST基因插入到载体pQE-30中构建pQE-30-GST，经IPTG诱导GST蛋白表达并用Westernblot鉴定。分别将huNSEl88-354、huPrP23-91和huDoppe124-152基因插入pQE-30-GST，转化E-coliM15并诱导表达融合蛋白。采用NiSepharose4B和(或)Glutathione Sepharose 4B纯化融合蛋白，并用羟胺裂解。结果 重组表达载体pQE-30-GST可有效地表达各种His-GST融合蛋白，并可用两种方法纯化不同大小的融合蛋白；利用羟胺可将目的蛋白肽段与His-GST蛋白有效裂解。结论 新型原核表达载体pQE-30-GST可进行多种蛋白质的表达，表达的蛋白质可经两种方法纯化以提高蛋白质的纯度，融合蛋白可经羟胺裂解获得目的蛋白质单体。     

干扰Itk表达抑制CVB3感染小鼠的炎症反应

目的 研究在病毒性心肌炎小鼠模型上敲减Itk蛋白的表达对小鼠炎症反应的影响.方法 BALB/c小鼠尾静脉注射表达Itk-shRNA的质粒后感染CVB3,第4天后观察Itk基因的抑制情况、小鼠存活率,PBMC增殖率及部分炎症性细胞因子的分泌水平.结果 Itk-shRNA转染至小鼠体内后脾细胞中Itk基因的mRNA水平与空白对照组及转染shRNAnon的对照组相比,敲减率约40％(P＜0.05).与转染shRNAnon组相比,Itk-shRNA组中Itk基因表达的抑制导致小鼠PBMC增殖活性降低约41％,小鼠的存活率提高(P＜0.05).Itk-shRNA组血清中细胞因子水平降低.结论 抑制Itk表达能有效降低小鼠PBMC的增殖,同时减少炎症相关细胞因子的分泌,提高小鼠的存活率.     

ITK蛋白调节小鼠脾淋巴细胞增殖分化的研究

目的 应用RNA干扰技术特异性抑制Itk基因的表达,观察Itk蛋白在淋巴细胞增殖和相应免疫因子合成分泌中的作用,进行Itk作为药物靶标的确认.方法 设计合成针对Itk基因的siRNA,将siRNA电转染至小鼠脾淋巴细胞,Western Blot检测Itk蛋白的表达、MTS方法检测细胞增殖率、ELISA方法检测细胞因子的含量.结果 实验组hk-siRNA在细胞水平上有效抑制了Itk蛋白的表达;Itk受抑制后细胞增殖率与对照组相比明显降低,差异有统计学意义,P<0.05;细胞因子IL-2,IL-4,IL-5,IFN-γ的分泌水平下降,P<0.05.结论 Itk表达受抑制后有效降低脾淋巴细胞的增殖率及细胞因子分泌的减少,研究验证了Itk在细胞增殖和炎性细胞因子分泌方面的重要免疫调节作用,为将其作为药物的靶基因提供实验依据.     

Itk蛋白在人PBMC增殖和细胞因子产生中的作用研究

利用RNA干扰的方法抑制人外周血单个核细胞(PBMC)中Itk基因的表达,探讨其抑制Itk后对人PBMC增殖和炎症性相关细胞因子产生的影响。设计针对Itk基因的siRNA序列,与外源表达Itk的pEGFP-C1-hItk质粒共转染至HeLa细胞,筛选出有效的干扰序列;利用电转染的方法将有抑制Itk作用的siRNA转染至人PBMC,检测Itk抑制状态,同时观察细胞增殖率及炎症性细胞因子产生水平的变化。实验表明,Itk-siRNA有效地抑制了Itk蛋白的表达;Itk受到抑制后细胞增殖率明显低于对照组(P0.05);几种重要炎性细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-5、IL-10和IL-4产生水平下降。实验验证了Itk蛋白在人PBMC增殖和炎性细胞因子产生方面的重要作用。     

抑制Itk表达对Jurkat细胞分泌细胞因子的影响

目的 研究在Jurkat细胞上敲减Itk蛋白的表达对细胞增殖及炎症相关的细胞因子产生的影响,为Itk作为小分子药物靶标提供可行性实验依据.方法 针对Itk基因设计合成三个shRNAs,通过与pEGFP-C1-hItk质粒共转染,观察其抑制Itk-GFP融合蛋白的表达情况,筛选有效序列包装成慢病毒颗粒.将慢病毒颗粒感染Jurkat细胞,观测Itk蛋白的表达水平、细胞增殖情况及细胞因子的变化.结果 Itk-shRNA1感染Jurkat细胞后Itk基因的mRNA水平与细胞对照组及感染shRNAnon的对照组相比,敲减率约55%,差异有统计学意义P＜0.05.Itk蛋白的敲减导致Jurkat细胞在受刺激时增殖降低,以未感染病毒的Jurkat细胞受刺激后酶标仪检测的A值为1,Itk-shRNA1感染组平均比值为0.54,shRNAnon对照组平均比值为0.83,两组差异有统计学意义,P＜0.05.Itk-shRNA1感染组中IL-2、IL-5、IL-10及IFN-γ等细胞因子水平均较shRNAnon对照组低,差异有统计学意义,提示Itk蛋白的表达减少导致Jurkat细胞产生细胞因子减少.结论 抑制Itk表达能有效降低淋巴细胞的增殖,同时减少与炎症相关细胞因子分泌.     

PrP可抑制tau介导的体外微管形成作用

目的研究朊蛋白（PrP）对微管相关蛋白（tau）介导的体外微管形成的影响。方法我们从兔脑组织中纯化出微管蛋白，并纯化出原核表达的tau和PrP蛋白。利用电子显微镜技术显示微管蛋白的聚集、tau对微管蛋白的聚集的影响，及PrP对tau介导的微管蛋白形成微管的影响。通过GST pull down实验研究tau与微管蛋白的相互作用，PrP对tau与微管蛋白相互作用的影响。结果电子显微镜负染显示纯化的微管蛋白在一定的实验条件下可聚集形成直径为25Nm的微管结构。在反应体系中加入tau后微管样结构的形成明显增加，而加入PrP后可显著地抑制tau对微管结构形成的促进作用。重组tau能与提取的天然微管蛋白在体外结合，而PrP可明显地抑制tau与微管蛋白的结合作用，并呈现剂量依赖关系。结论tau蛋白可促进微管蛋白形成微管结构，而PrP可通过与tau的相互作用抑制微管的形成。     

短双链RNA对柯萨奇B组3型病毒体外感染的抑制作用研究

目的利用RNA干扰技术，在细胞、蛋白和基因水平上观察短双链RNA对柯萨奇病毒体外感染Hela细胞的增殖抑制作用、对病毒RNA复制和蛋白合成的影响。方法应用病毒致细胞病变作用保护实验、空斑形成减少实验、Western Blot、RT-PCR等方法，在体外检测其抗CVB3病毒作用。结果设计、合成的8条SiRNA中，针对基因组2B、VP4、2A、3C区的SiRNA-2、SiRNA-3、SiRNA-6、SiRNA-7具有不同程度的抑制病毒作用。其中，病毒基因组2B的SiRN．2作用效果最好，对Hela细胞CVB3感染72h后致细胞病变和空斑形成的抑制率为95％，抑制病毒蛋白的合成，病毒基因的复制水平也显著降低，在病毒0．1、0．01、0．001、0．0001 MOI感染水平上对CVB3致细胞病变作用的抑制率分别为30％、70％、88％和99％（48h）。结论针对CVB3基因组2B的SiRNA-2具有较强的抑制柯萨奇B3型病毒感染的作用。