BSL-2实验室开展SARS-CoV-2核酸检测过程中的生物安全管理

目的:总结生物安全二级(bio-safety level 2,BSL-2)实验室开展新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)核酸检测过程中的生物安全管理经验与效果。方法:检测样本来源于2020年2月21日到2020年11月5日送达中国疾控中心病毒病预防控制所病毒资源中心科室的人体咽拭子、鼻拭子、痰液、尿液、便液等。在遵循常规生物安全管理要求的基础上,在检测过程中积极进行人员、岗位、标本、过程、安全巡视等生物安全管理。结果:共开展了27692人次样本的SARS-CoV-2核酸检测,平均每天检测(2.32±0.11)批样本,每批平均检测(87.22±6.83)件样本,BSL-2实验室平均每天工作时间(3.43±0.23)h。在检测过程中未出现任何生物安全问题。结论:BSL-2实验室在长时间的SARS-CoV-2核酸检测过程中,要积极从多方面加强生物安全管理,从而保障检测工作安全有序进行。     

CVB32A蛋白酶抑制帽样结构依赖的蛋白翻译

目的探讨CVB3的蛋白酶2A对真核细胞帽样蛋白翻译和内部核糖体进入位点（IRES）翻译机制的影响。方法构建表达载体pcDNA3．1—2A,将此表达载体分别与pEGFP—N1、pGL3（F-luc）以及pIRES-GFP载体共转染细胞后,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达,检测荧光素酶蛋白的表达。WesternBlot检测CVB3病毒和pcDNA3．1-2A对真核生物翻译起始因子4GI（eIF4GI）及多聚A尾结合蛋白（PABP）的影响。结果pcDNA3．1之A可以减少帽样依赖的GFP和荧光素酶蛋白的表达,但可以促进IRES依赖的GFP表达。CVB32A基因质粒转染和CVB3感染后,均可发现细胞内elF4G的切割现象;同时CVB3对PABP也有降解作用,而CVB32A基因转染对PABP无明显作用。结论CVB3的蛋白酶2A抑制真核细胞帽样途径蛋白翻译,促进IRES途径的翻译。     

EMCV3C蛋白酶抑制真核细胞蛋白质合成的研究

目的 探讨脑心肌炎病毒（EMCV）的3C蛋白酶对真核细胞转录及翻译机制的影响.方法 构建真核表达载体pcDNA3.1-3C,将表达载体分别与帽样依赖的绿色荧光蛋白（GFP）表达载体pEGFP-N1和萤火虫荧光素酶（Fluc）载体pGL3载体共转染细胞后,检测GFP和Fluc的表达.Western Blot检测EMCV病毒和pcDNA3.1-3C对真核生物翻译起始因子4GI（eIF4GI）及多聚A尾结合蛋白（PABP）的影响.RT-PCR检测pcDNA3.1-3C对GFP mRNA转录水平的影响.结果 EMCV-3C可以抑制帽样依赖的GFP和Fluc的表达.EMCV 3C和EMCV病毒感染均导致细胞内PABP发生切割,而对eIF4GI均无明显作用.EMCV-3C也可导致GFP基因mRNA转录水平下降.结论 EMCV的蛋白酶3C通过mRNA转录水平的抑制和PABP的切割而抑制真核细胞帽样结构依赖途径的蛋白翻译,从而抑制蛋白质的合成.     

一种验证内部核糖体进入位点的双荧光素酶报告载体构建

目的构建一种能够验证内部核糖体进入位点的双荧光素酶报告载体,为验证内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)活性提供了方法。方法以双荧光素酶报告基因载体psiCHECK-2为基础,将发卡结构插入到海肾荧光素酶(R-Luc)基因与萤火虫荧光素酶(F-Luc)基因之间,构建载体psiCHECK-IRES。为了验证载体是否有效,通过同源重组技术将Encephalomyocarditis virus(EMCV)的IRES序列插入到psiCHECK-IRES载体的发卡结构与F-Luc之间,形成载体psiCHECK-IRES-EMCV。以psiCHECK-2质粒做模板建立F-Luc与R-Luc的扩增标准曲线。将psiCHECK-IRES与psiCHECK-IRES-EMCV质粒转染BHK-21细胞,利用RT-qPCR检测F-Luc与R-Luc的拷贝数;将psiCHECK-IRES与psiCHECK-IRES-EMCV质粒分别转染BHK-21细胞,24 h后利用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。结果经过测序证实带有发卡样结构的双荧光素酶表达载体psiCHECK-IRES的载体序列。RT-qPCR结果显示F-Luc与R-Luc mRNA的拷贝数大致相同,证明未出现异常的单顺反子转录本,避免F-Luc读数出现假阳性;插入EMCV IRES的psiCHECK-IRES-EMCV载体表达的F-Luc/R-Luc比值是空载体的53.35倍,证明EMCV的IRES序列能够在构建的载体上起始F-Luc基因的表达。结论本研究构建了可用于验证病毒或者细胞依赖IRES表达的双荧光素酶报告载体psiCHECK-IRES。     

PrP106-126多肽抑制14-3-3β蛋白二聚体形成的研究

目的 探讨PrP蛋白和PrP106-126多肽对14-3-3蛋白二聚体形成的影响 方法 将重组表达纯化的0.25 μg、0.5 μg和1μg PrP蛋白、人工合成的PrP06-126肽分别与重组的14-3-3β共孵育,分别通过非变性聚丙烯酰胺凝胶的Western Blott检测PrP蛋白和PrP106-126肽对14-3-3β二聚体和多聚体的形成影响.将不同浓度的PrP与250 μmol/L的PrP106-126肽和14-3-3蛋白共孵育,检测PrP蛋白对PrP106-126肽对14-3-3β二聚体和多聚体的形成影响.随后,将200μmol/L、100 μmol/L、50 μmol/L的PrP106-126多肽分别作用于HeLa细胞8h后,检测细胞内的14-3-3二聚体形成.结果 PrP蛋白与14-3-3蛋白共孵育后,14-3-3二聚体和多聚体的信号随着PrP浓度的增加明显增强；PrP106-126多肽共孵育时,14-3-3二聚体和多聚体的信号随着PrP浓度的增加而减弱；不同浓度的PrP蛋白可以拮抗PrP106-126多肽对14-3-3β二聚体的形成.而且PrP106-126多肽可以干扰HeLa细胞中的二聚体形成.结论 PrP蛋白促进14-3-3二聚体的形成,而PrP106-126多肽干扰二聚体的形成,且PrP蛋白具有拮抗PrP106-126肽干扰14-3-3二聚体形成的作用.     

肠道病毒71型抵抗Ⅰ型干扰素诱导的抗病毒作用

目的 研究肠道病毒71型(EV71)抵抗Ⅰ型干扰素(interferon,IFN)诱导的抗病毒作用.方法 将1000 U/ml的Ⅰ型干扰素(α,β)加入HeLa细胞后,去除上清中的干扰素,感染带有GFP的重组单纯疱疹病毒(HSV-1)和EV71,观察GFP的表达和PCR检测HSV-1核酸,判断Ⅰ型干扰素对HSV-1的作用.通过RT-PCR方法检测EV71 2A基因的表达从而判断EV71病毒的复制能力.结果 Ⅰ型干扰素(α,β)诱导HeLa细胞产生抗病毒蛋白而有效地抑制重组HSV-1 GFP的表达和核酸扩增.而EV71 2A的RT-PCR结果证实EV71可在Ⅰ型干扰素(α,β)作用后的HeLa细胞中有效增殖.结论 Ⅰ型干扰素(a,β)诱导产生抗病毒蛋白;EV71可在Ⅰ型干扰素(α,β)诱导产生抗病毒蛋白的HeLa细胞中有效增殖.     

《人间传染的病原微生物目录》中病毒部分的解读

为了更好的落实《中华人民共和国生物安全法》和《病原微生物实验室生物安全管理条例》相关规定, 2023年8月国家卫生健康委发布通告国卫科教发〔2023〕24号, 正式印发了《人间传染的病原微生物目录》(以下简称《目录》)。随着新的病原微生物不断出现, 对现有病原微生物认识不断更新, 以及实验室生物安全研究不断深入, 原有的《人间传染的病原微生物名录》已不能够满足需求, 因此颁布了《目录》。本文旨在详细解读《目录》中病毒部分, 包括制定背景、原则、过程以及主要内容, 以便更好的了解和认识《目录》。     

2015—2021年徐州市呼吸道合胞病毒感染与气象因素的关联分析与预测

目的分析呼吸道合胞病毒感染与气象因素的关联, 预测并解释其变化趋势。方法收集2015—2021年徐州市住院儿童的严重急性呼吸道感染病例。通过实时荧光聚合酶链式反应检测呼吸道合胞病毒(RSV), 使用SPSS 26.0软件对结果进行统计分析。使用2015—2019年数据构建负二项回归模型, 探究对RSV感染有影响的气象因素。使用多变量时间序列模型预测2020—2021年RSV检出率。结果 2015—2021年共收集1 663例严重急性呼吸道感染患儿样本, 其中RSV检出阳性样本218例(13.1%)。RSV季节效应明显, 以1年为周期出现冬季(12月至次年2月)为高峰, 夏季(6—8月)为低谷。负二项回归分析表明, 月平均气温、月平均相对湿度和月总日照时数可能是本地区RSV感染的影响因素。以日照时数为协变量的时间序列模型预测结果表明, 2020年预测效果较好, 实际值与预测值接近。2021年的预测变化趋势一致, 但实际值高于预测值。结论月平均气温降低、月平均相对湿度升高或月总日照时数延长可能是本地区儿童中RSV感染增加的影响因素。可以使用2015—2019年数据建立预测模型, 其中202...     

CVB3诱导Th17/Treg失衡导致小鼠病毒性胰腺炎

目的构建CVB3诱导的小鼠胰腺炎模型, 观察胰腺组织病理学损伤和浸润Th17/Treg细胞的占比变化。方法 BALB/c小鼠腹腔注射CVB3构建急性病毒性胰腺炎模型, 通过HE染色观察胰腺病理学改变;q-PCR检测胰腺组织病毒核酸载量和细胞因子(IFN-γ、IL-6和IL-17)mRNA的相对表达量;流式细胞术检测胰腺组织浸润细胞CD45+CD3+T细胞、CD4+和CD8+T细胞、Th17和Treg细胞占比。结果 CVB3感染第3天胰腺组织病毒核酸载量为0.96±0.18, 且随感染时间点推移而逐渐降低;与3dpi组相比, 7dpi组胰腺组织病毒核酸载量有降低趋势(0.96±0.18 vs. 0.62±0.14), 但无统计学差异。胰腺组织炎症细胞浸润在7dpi后明显增加, 损伤评分>2;浸润的Th17细胞(1.05±0.21 vs. 22.13±5.79)和Treg细胞(3.11±0.78 vs. 8.25±1.30)在CD4+T细胞中占比在感染后7天同时升高(P<0.05), 且Th17/Treg比值也明显增高(P<0.01)。与对照组相比, CVB3感染第7天,...     

2015-2021年江苏省徐州市住院儿童严重急性呼吸道感染病例鼻病毒感染分析

目的 了解2015—2021年江苏省徐州市住院儿童严重急性呼吸道感染（SARI）病例中病毒谱的构成，进一步探究人鼻病毒（hRV）的分子流行病学特征。方法 使用实时荧光定量聚合酶链式反应技术（RT-PCR）对咽拭子标本中的常见呼吸道病毒进行检测。巢式PCR法扩增hRV阳性样本的VP4/VP2区基因序列，构建系统发育树，并进行同源性分析。结果 1 663份标本中呼吸道病毒检出阳性641份（38.54%）。hRV的检出率位居第1位，为13.95%(232/1 663)。2018年hRV的检出率明显较高（28.08%）；呈现夏秋高峰的季节性流行特征。2020年后，hRV在1—6月的检出率明显降低，但7月后检出率迅速回升，且在3～6岁年龄组中明显上升，≥6岁组中明显下降。hRV的VP4/VP2区序列比对分析发现涉及29种血清型，以hRV-A组为主。结论 hRV是2015—2021年徐州市住院儿童SARI病例中主要流行的呼吸道病毒，以hRV-A组为主要流行，血清型具有多样性。hRV的流行在2020年受到了短暂的抑制之后迅速回升，提示需要对hRV感染进行持续监测。