补体C5b-9复合物诱导大鼠肾系膜细胞iNOS mRNA表达的实验研究

观察人血清补体C5b 9复合物对大鼠肾小球系膜细胞 (MC)表达诱生性一氧化氮合酶 (iNOS)mRNA的影响。方法 :首先提取人血清补体C5b 9复合物 ,然后用人C5b 9复合物刺激培养的大鼠MC ,检测MC在受C5b 9复合物刺激后3、6、2 4和 48h时iNOSmRNA的表达情况。同时检测其培养上清液中一氧化氮 (NO)代谢产物———硝酸根 (NO3- )和亚硝酸根(NO2- )含量的变化。结果 :用人C5b 9复合物刺激培养大鼠的肾MC能使其表达iNOSmRNA ,培养上清液中NO3- NO2- 含量也明显升高。人C5b 9复合物对MC的刺激作用能部分被相应的抗人C5b 9复合物抗体和RNA合成抑制剂———放线菌素D所抑制。结论 :人补体C5b 9复合物具有刺激大鼠肾MC合成NO的作用。     

HBV相关肝细胞癌中HBV亚基因整合与表达研究

目的 探讨乙型肝炎病毒亚基因在肝细胞癌发生中的作用。方法 以BamH I、Bgl Ⅱ酶切32kb HBV DNA，回收其HBs、HBx、HBc、PreS亚基因片段，以地高辛甙元标记成探针。以HBV探针Southern杂交分析其存在状态，以HBV亚基因探针Northern杂交检测亚基因转录。结果 HBV阳性肝细胞癌中，整合型与混合型标本分别为63．6%和36．4％，纯整合型标本中，PreS、HBs、HBx、HBc mRNA阳性率分别11．1％、44．4％、55．6％、11．1％。结论 HBV DNA以整合于染色体上作为存在的主要方式，整合的HBV DNA有一定程度的转录，可指导相应蛋白合成而影响肿瘤的发生。     

HBV DNA及HBxDNA亚片段在肝癌细胞内的整合及作用

为探讨ＨＢＶＤＮＡ及其亚基因片段ＨＢｘＤＮ在肝细胞肝癌（ＨＣＣ）中整合特点用机制，制备了地高辛标记的３．２ｋｂＨＢＶＤＮＡ全基因及０．５９ｋｂＨＢＶＤＮＡ／ＢａｍＨＩ，ＢｇｌⅡＢＨｘＤＮＡ亚基因探针。点杂交、原位杂交及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测ＨＢＶＤＮＡ的存在情况，筛选ＨＢＶＤＮＡ纯整合标本，以ＨＢｘＤＮＡ探针检测ＨＢｘＤＮＡ在ＨＣＣ染色体的整合。结果显示ＨＢＶＤＮＡ在肝细胞内以核型为主（７０％）     

非放射性HBV－DNA探针在乙型肝炎病毒检测中的应用

以地高辛甙元随机引物法标记ＨＢＶ－ＤＮＡ探针，以此探针检测慢性乙型肝炎患者的血清、肝组织，同时以ＥＬＩＳＡ法检测血清ＨＢｅＡｇ、ＨＢｃＡｂ。结果：血清ＮＢｅＡｇ阳性率２７％（１０／３７），血清ＨＢＶ－ＤＮＡ检出率５７．１％（２０／３５），两者有显著性差异。血清ＨＢｃＡｂ阳性率７８．４％（２９／３７），肝组织ＨＢＶ－ＤＮＡ检出率８３．８％（３１／３７），两者无显著性差异。血清与肝组织ＨＢＶ－ＤＮＡ检出率有显著性差异。提示：血清ＨＢＶ－ＤＮＡ检测是较ＨＢｅＡｇ更为准确客观反映血液带毒状况的指标。而准确反映肝脏带毒状况的指标是肝组织ＨＢＶ－ＤＮＡ检测。当ＨＢｅＡｇ阴转，血清ＨＢＶ－ＤＮＡ阴性而肝组织ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性时，需注意肝硬化及肝癌的发生。     

抗胸腺细胞血清性肾炎模型大鼠肾小球中C5b-9的沉积及NO、TNFα含量分析

目的: 探讨抗胸腺细胞血清性肾炎(ATSN)大鼠肾小球内C5b-9复合物的沉积与某些炎症介质和细胞因子如:一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子α(TNFα)的含量情况。 方法: 大鼠一次性静脉注射抗胸腺细胞抗血清(ATS)建立ATSN模型,定期对ATSN大鼠肾小球中的补体C5b-9复合物进行免疫组化染色定位、显微图像扫描半定量分析;并对有C5b-9包绕的肾小球系膜细胞(MC)进行计数。测定ATSN大鼠肾中诱生型NO合酶(iNOS) mRNA的表达、尿液中NO的代谢产物(NO^-₂／NO^-₃)及TNFα的排泄量。 结果: ATSN模型大鼠肾小球MC先溶解坏死后继发增生,病变早期(溶解时相)补体C5b-9复合物主要定位于肾小球系膜区及MC表面;随着病程的进展,被C5b-9包绕的MC逐渐减少, 病程初期ATSN大鼠肾小球MC有明显的 iNOS mRNA表达, 尿液中NO^-₂／NO^-₃ 和TNFα的排泄量也明显增加。在ATSN病变的增生阶段(一般7 d后),上述指标的变化逐渐趋缓。 结论: ATSN模型大鼠肾小球中MC逐渐溶解与补体C5b-9沉积及NO和TNFα的合成与释放有一定关系。     

HBx-DNA探针的研制及在肝癌发生机制研究中的应用

将非放射性标记物地高辛甙元用随机引物法由ｐＢＲ３２２－２ＨＢＶ／ＥｃｏＲⅠ酶切片段（３．２ｋｂ）制备ＨＢＶ－ＤＮＡ探针及由ＨＢＶ／ＢａｍＨⅠ、ＢｇｌⅡ酶切片段（０．５９ｋｂ）制备ＨＢｘ－ＤＮＡ探针。将Ｄｉｇ－ＨＢＶＤＮＡ探针用斑点杂交、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转膜杂交检测筛选肝细胞性肝癌ＨＢＶ－ＤＮＡ整合型标本，进而用Ｄｉｇ－ＨＢｘＤＮＡ探针检测ＨＢＶ－ＤＮＡ纯整合型肝细胞性肝癌中ＨＢｘ的存在情况。结果显示，７５％（３３／４４）的肝癌ＤＮＡ中有ＨＢＶ－ＤＮＡ存在，其中，以纯整合型方式存在的为６３．６％（２１／３３），混合型为３６．４％（１２／３３），无游离型。纯整合型ＨＢＶ－ＤＮＡ片段中，ＨＢｘ－ＤＮＡ阳性率为９０．５％（１９／２１）。提示ＨＢＶ在肝细胞性肝癌的发生中起着重要的作用，ＨＢＶ－ＤＮＡ可能以片段性整合的方式存在于肝癌细胞染色体上，其中以ＨＢｘ基因的整合为主。     

补体C5b-9复合物刺激大鼠肾小球系膜细胞合成NO的机制探讨

目的:探讨人C5b-9复合物刺激大鼠肾小球系膜细胞(MC)合成一氧化氮(NO)的机制。方法:用人C5b-9复合物刺激培养的大鼠肾小球MC诱生肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素1β(IL-1β),并用抗TNFα或抗IL-1β单克隆抗体进行处理。在上述基础上,分析处理3 h、6 h及24 h时与NO升高有关的某些指标的变化。结果:经C5b-9复合物刺激6、24 h后的MC(C5b-9组)产生TNFα明显高于对照组,并能被TNFα单抗逆转。用C5b-9复合物刺激MC未见IL-1β的产生。另用C5b-9刺激3 h时可见MC表达iNOS mRNA,而在刺激6 h和24 h时,MCiNOSmRNA表达,MC内cGMP含量及培养上清液中NO³_-/NO²_-含量均显著高于对照组。不过,C5b-9刺激时加用TNFα单抗处理,这些指标在6 h、24 h时均较C5b-9组低。结论:C5b-9复合物早期(3 h)能诱导MC表达iNOS mRNA,而6h后NO的升高则与MC释放的TNFα作用有关。     

人参皂甙Rg3抗小鼠Lewis肺癌的机制研究

目的以小鼠Lewis肺癌为肿瘤模型探讨人参皂甙Rg3抗肿瘤机制。方法以肺癌细胞系LLC荷瘤C57/BL小鼠建立小鼠肺癌模型,随机分为人参皂甙Rg3组、阳性药顺铂组和模型组,分别给予人参皂甙Rg3、顺铂和生理盐水;同时设立空白对照组。以肿瘤质量、抑瘤率观察人参皂甙Rg3的抗肿瘤效果;以流式细胞术测定脾脏CD4+T细胞、CD8+T细胞数量及比值;以Elispot技术检测机体肿瘤抗原特异性CTL的诱生情况;以肝脏指数、脾脏指数、胸腺指数判定人参皂甙Rg3的毒副作用。结果人参皂甙Rg3组抑瘤率高于顺铂组,差异具有统计学意义(P<0.05)。生理盐水组小鼠脾脏CD4+T细胞、CD8+T细胞百分率比正常小鼠低,而人参皂甙Rg3组和顺铂组高于生理盐水组,差异具有统计学意义(P<0.05)。人参皂甙Rg3组肿瘤特异性IFN-γ斑点数明显增多,与生理盐水组相比具有统计学差异(P<0.05),顺铂组脾脏无肿瘤特异性IFN-γ斑点出现。和模型组相比较,人参皂甙Rg3组小鼠肝脏、脾脏、胸腺指数无明显差异,而顺铂组的肝脏、脾脏、胸腺指数低于人参皂甙Rg3组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 LLC细胞荷瘤小鼠具有明显的免疫抑制现象,人参皂甙Rg3可显著增加脾脏CD4+T细胞、CD8+T细胞阳性率并促进肿瘤特异性CTL细胞诱生,人参皂甙Rg3无肝脏、胸腺、脾脏毒性。     

HBV亚片段基因探针的制备及其在肝癌研究中的应用

以ＥｃｏＲⅠ酶切质粒ｐＢＲ３２２－２ＨＢＶＤＮＡ，回收ＨＢＶ３．２ｋｂＤＮＡ，继以ＢａｍＨⅠ、ＢｇｌⅡ酶切ＨＢＶ－ＤＮＡ，回收ＨＢｓ０．９ｋｂ及ＨＢｘ０．５８ｋｂＤＮＡ片段。以地高辛随机引物法标记上述回收片段，获得高度敏感性及特异性的ＨＢＶ全基因及亚片段基因探针。以ＨＢＶ全基因探针通过斑点杂交、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转膜杂交检测了４４例肝细胞性肝癌组织标本中ＨＥＶ－ＤＮＡ的存在情况及存在特点，继以ＨＢｓ、ＨＢｘ亚基因探针检测了ＨＥＶ纯整合型肛癌标本中各亚基因片段的整合情况。结果显示：７５％肝癌组织中有…     

TH细胞在记忆性CTL介导的肿瘤抑制中的作用研究

目的 观察记忆性CTL的抑瘤作用是否需要抗原特异性TH细胞的辅助。方法 表达OVAT细胞表位SIINFEKL特异性TCR的T细胞转输RAG^-l-小鼠，经相应T细胞表位多肽刺激后产生记忆性CTL，将此记忆性CTL转输已产生特异性和非特异性TH细胞的C57BL／6小鼠体内并接种肿瘤细胞EG7。结果 经T细胞表位多肽免疫后，SIINFEKL特异性TCR T细胞成功在RAG^-l-小鼠体内增殖并分化为记忆性CTL；抗原特异性TH细胞可辅助产生较多效应性CTL但并没有完全的肿瘤抑制作用；记忆性CTL的完全抑瘤活性需要抗原特异性TH细胞的辅助。结论机体对肿瘤的长期完全杀伤作用不但需要肿瘤特异性抗原诱导产生的记忆性CTL，而且需要特异性TH细胞的辅助，肿瘤疫苗的设计必须包括特异性的CTL表位多肽和辅助性TH细胞多肽。