基于CRISPR-Cas13的单增李斯特菌RNA快速检测方法的建立

为实现食品中单增李斯特菌污染的快速检测,本研究构建了一种基于CRISPR-Cas系统和Broccoli适配体的RNA均相检测技术。利用Cas 13与cr RNA锚定序列结合形成识别元件cr RNA-Cas13复合物,靶标RNA存在时可激活Cas 13的非特异性RNase活性,并利用点亮型RNA适配体Broccoli作为信号探针,监测cr RNA此-Cas13的活化状态。荧光值的变化与单增李斯特菌浓度存在线性关系,利用来检测单增李斯特菌。本研究所构建的检测可在30min内完成对于单增李斯特菌的的识别与检测,检出限为148CFU/m L,对细菌具有良好的检测特异性,可区分大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和蜡样芽孢杆菌。在牛奶模型中单增李斯特菌的加标回收率为95.15%～97.99%。该方法具有较好的灵敏度、特异性,可直接靶向检测致病菌RNA,无需逆转录、PCR扩增和核酸标记,简化了实验流程,对于实现食品中单增李斯特菌的现场检测及生物安全控制具有重要意义。     

地衣芽孢杆菌的双位点荧光原位杂交检测

为了研究芽孢杆菌荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,FISH）检测的影响因素,该实验以地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）为研究对象,分析了不同探针、菌体预处理方式、细胞通透化处理条件及杂交条件对FISH检测结果的影响,并进一步对选出来的探针进行特异性检测。结果表明,在设计的探针中有两个可以特异性识别地衣芽孢杆菌,且使用双探针检测比单探针荧光效果更好,提高1.54倍灰度值;当反应条件为超声分散菌体时间120 s、溶菌酶处理40 min、杂交时间为6 h、甲酰胺浓度为30%时检测结果最佳,其灰度值为41.16、菌体检出率为96.35%;特异性检测表明该方法可以特异性识别地衣芽孢杆菌。该研究建立了一种操作简单的地衣芽孢杆菌的双位点荧光原位杂交检测方法,无需核酸提取及扩增,且具有较强特异性。     

稀土铽离子介导的非标记适配体传感器评估食品中的重金属银污染

作为最具毒性的重金属之一,银在食品和环境中的污染对人体健康会造成严重危害。该研究基于稀土铽离子（Tb3+）能够结合单链DNA发出特征荧光的原理,利用Ag+能与胞嘧啶（C）结合形成C-Ag+-C结构以组成双链DNA的特性,构建了一种特异性识别Ag+的非标记核酸适配体荧光传感器。该传感器通过Tb3+对单双链DNA结构变化灵敏的特征荧光响应,能够实现对Ag+的高灵敏和快速的定量检测。该方法对Ag+的检测限为391.50 nmol/L,满足国家对于饮用水中Ag+限量检测的要求（0.05 mg/L,即 463.50 nmol/L）。该方法的回收率测定结果在93.02%~102.72%范围内,其相对标准差范围为1.27%~7.14%,证明了它的应用有效性;相较于其他的分子检测方法,该方法具有无需进行化学标记以降低成本,且操作简便,检测响应速度快等优点,为临场快速检测重金属银污染提供了一种可能的途径。     

EDTA和精氨酸对锌电积过程影响的研究

考察了EDTA和精氨酸对Zn-H₂SO₄-ZnSO₄体系锌电积过程电流效率、单位能耗和表面形貌的影响, 并运用线性扫描、循环伏安法研究了EDTA和精氨酸对锌电积过程电化学行为的作用。结果表明: EDTA和精氨酸均能提高电流效率、降低单位能耗、改善锌板表面形貌, 二者的最佳加入浓度分别为1 mg/L和3 mg/L, 锌电积单位能耗均已降到2 900 kW·h/t以下。通过电化学和表面形貌分析可知, EDTA促进锌的析出, 精氨酸抑制氢的析出, 两者对锌电积过程影响机理是不同的。     

基于功能核酸的食品重金属污染快速检测进展

食品安全与人类健康息息相关。重金属污染已成为食品安全领域的突出问题,为保证食品安全,构建快速、廉价和可推广的食品重金属污染检测方法显得尤为重要。近年来,以功能核酸为基础的生物传感及分析技术引起了广泛关注。核酶和核酸适配体等功能核酸作为一种新型的生物识别分子,可实现对金属离子的特异性识别,在构建高灵敏、高选择性的食品重金属分析检测平台方面具有巨大的应用潜力。本文综述了功能核酸在重金属(铅、汞和镉)污染检测领域的应用进展,重点介绍了由功能核酸构建的荧光传感器和比色传感器,及功能核酸与纳米粒子复合构建的核酸纳米传感器。此外,考虑到食品重金属离子检测所涉及的区域范围广、样品数量多等问题,本文突出了功能核酸与微流控技术及便携检测设备整合的检测平台,为临场的食品重金属污染分析提供思路。     

VFDB注释法在食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因分型分析中的应用

目的 应用VFDB注释法对食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因进行分型并评价其准确性。方法 分别使用VFDB注释法和特异引物PCR方法对2009—2016年从北京地区食品中分离的53株金黄色葡萄球菌的18种肠毒素基因（包括传统肠毒素基因sea~see,新型肠毒素基因seg~sej和类肠毒素基因sek~seu）携带情况进行分析。将VFDB注释法所得肠毒素基因序列上传至NCBI,使用BLASTX程序和refseq_protein数据库对注释结果进一步核对。结果 VFDB注释法和PCR方法都检测出53株金黄色葡萄球菌分离株中有45株携带1种或多种肠毒素基因,有8株未携带肠毒素基因,肠毒素基因的总携带率为84.91%（45/53）,经典肠毒素基因的携带率为58.49%（31/53）。45株携带肠毒素基因的分离株中,16株菌（35.56%,16/45）肠毒素基因VFDB分型结果与PCR一致,29株菌（64.44%,29/45）的肠毒素基因VFDB分型结果与PCR不一致。经BLASTX核对,VFDB注释法可能误判的基因型包括sea/sed、sea/sej、sea/sep、sea/ser、seg/ser和sek/sei（VFDB注释/BLASTX核对）。结论 VFDB注释法可对食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因进行分型分析,但是对注释为sea、seg和sek的序列建议采用BLASTX程序和refseq_protein数据库进一步核对,以提高基因分型的准确性。     

基于铽离子的非标记核酸适配体传感器检测黄曲霉毒素B1

黄曲霉毒素B₁（aflatoxin B₁, AFB₁）具有致癌、致畸和致突变效应,被国际癌症研究机构（IARC）列为一类致癌物,对消费者健康有巨大威胁。当Tb3＋单独存在溶液中时,检测不到其特征荧光;当Tb3＋与单链核酸结合后可形成络合物,使得Tb3＋特征荧光显著增强;当加入靶分子AFB₁后,由于AFB₁可与核酸适配体结合,从而引起构象变化形成双链,Tb3＋不能与双链核酸结合发光,使得荧光增强得到抑制。本研究基于上述原理构建了一种基于稀土铽离子（Tb3＋）特征荧光效应的非标记核酸适配体传感器,可实现对 AFB₁的均相快速检测。该方法利用荧光信号的变化对AFB₁进行定量分析,检测限为1.84 ng/mL。由于核酸适配体对靶分子识别具有专一性,可以在复杂的基质中准确区分检测出AFB₁及其他真菌毒素。在回收率实验中核酸适配体传感器得到的回收率为 95.94%~107.12%,验证了该方法的有效性。该检测方法不需要对核酸进行修饰标记,可节约成本,检测全过程操作简单,且不需要分离,在一个洁净的离心管内即可完成,可实现对AFB₁的均相检测。     

基于脱氧核酶-荧光共振能量转移效应的食品中铅离子快速检测

为实现食品中铅（Pb2+）污染的快速检测,该研究构建了一种基于Pb2+依赖型脱氧核酶（DNAzyme）及荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）效应的“Turn on”型铅离子检测传感器。荧光猝灭基团BHQ1可以作为FRET受体猝灭EvaGreen的荧光。当Pb2+存在时,底物链的特异性切割反应可以减弱BHQ1对EvaGreen的猝灭效果,BHQ1随底物链的断裂而释放,远离供体EvaGreen,因此FRET效应减弱,供体EvaGreen的荧光得以保留。该研究利用Pb2+诱导的FRET效应的减弱及EvaGreen荧光信号的增强可以对铅离子进行定性、定量分析。当脱氧核酶臂长为15 nt~5 nt、EvaGreen浓度为1×、底物链与酶链的浓度分别为400 nmol/L与100 nmol/L时,探究了该方法的检出限及线性范围。该反应可在室温条件下3 min内完成,同时对铅离子具有高度的特异性,可以区分不同的金属离子,并且成功应用于新鲜鸡蛋及自来水中的铅离子定量分析,加标回收率为86.79%~113.32%。该研究设计的“Turn on”型铅离子检测传感器可于室温条件下进行一管混反应,无需扩增,反应迅速,为检测食品中的铅污染提供了一些思路。     

基于氮掺杂荧光碳量子点的食品金属铜污染均相快速检测

目前重金属铜的检测方法普遍存在操作繁琐、样品前处理复杂、消耗时间长和检测成本高等问题,限制了食品重金属铜污染的检测。该研究合成了一种铜离子（Cu2+）特异性响应的氮掺杂荧光碳量子点,实现了铜污染的均相快速检测,该碳量子点具有优异的水溶解度和生物相容性,其荧光量子产率为33.27%。该方法可以在一个离心管内、在室温环境下实现对Cu2+的高灵敏检测,检测动态范围是5~50 μmol/L,检出限为5.48 μmol/L,并已成功应用于水样中Cu2+的检测。该碳量子点有望成为食品铜污染的现场检测有效工具,具有农作物、水体及土壤中Cu2+检测的潜在应用价值,有助于食品铜污染的防控,此外,该方法具有高时效性、高准确性、高稳定性、低成本、低检测要求的特点,符合当前食品重金属安全监管的需求。