融合蛋白CR2-GDH固定化及不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯

比较介孔分子筛材料SBA-15、MCM-41、海藻酸钙、改性二氧化硅4种载体固定化融合蛋白CR2-GDH其酶固载量和酶活回收率,选择SBA-15为固定化载体。研究固定化条件对固定化融合酶量的影响以及固定化酶的稳定性,固定化酶在双相体系催化不对称还原反应。结果表明,在pH值为5.5、酶浓度为1.4mg/mL、反应1h条件下,固定化酶量为27.7mg/g。加入25mmol/L的Ca²⁺,固定化酶的酶活回收率由58.6%提高到78.1%。与游离酶相比,固定化酶的热稳定性显著提高,40℃条件下酶活回收率提高19.1%。固定化酶水相中反复使用7批次后,剩余活性仍超过30%,具有较好的操作稳定性。与游离酶相比,固定化酶更耐受烷烃类有机溶剂。在水/有机溶剂双相反应体系中,Ca²⁺/SBA-15固定化酶和游离酶催化相比,产物得率提高23.8%。     

新型异亮氨酸双加氧酶及其重组大肠杆菌合成羟基异亮氨酸

异亮氨酸双加氧酶（IDO）可特异性的转化底物L-异亮氨酸（L-Ile）生成4-羟基-L-异亮氨酸（4-HIL）,该产物具有促进胰岛素分泌的功能,可用于抗糖尿病、降胆固醇等。本研究结合了酶标显色和薄层层析（TLC）的方法从自然界中筛到了具有IDO活性的菌株,并将该菌株中的目的基因ido克隆到大肠杆菌中,获得重组表达菌株,并且验证该菌具有IDO的转化功能。本研究优化了转化反应体系和条件,同时通过30℃过夜温育菌体细胞的方法,使该菌株全细胞转化合成4-HIL的产率达到85%以上。     

(R)-1-苯基-1,2-乙二醇脱氢酶的纯化及酶学性质

高压匀浆破碎近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCCM203011)得酶粗提液,经乙醇沉淀、DEAE-Sephacel离子交换层析、SuperdexG-75凝胶层析及亲和(Cibacron Blue 3GA)层析纯化得到以NADP+为辅酶的醇脱氢酶,SDS-PAGE电泳鉴定为单一条带,纯化后比活力提高20倍.HPLC凝胶柱层析法检测相对分子质量为45 000,SDS-PAGE电泳测得相对分子质量为43 000,表明该酶为单亚基结构.以(RS)-1-苯基-1,2-乙二醇(简称苯乙二醇)为底物,该酶最适反应温度为45℃,最适反应pH值为8.0.金属离子中Mg2+对酶活的有一定激活作用.以纯酶催化转化消旋体苯乙二醇,该酶优先选择(R)型对映体为底物.     

基于pH下降速率的反馈补料策略高密度培养保加利亚乳杆菌NQ2508

保加利亚乳杆菌是酸奶发酵剂和益生菌制剂的重要菌种,其高密度培养对于提高菌种在应用产品生产中的效率具有重要的现实意义。葡萄糖浓度和发酵pH是影响保加利亚乳杆菌生长的关键因子,底物葡萄糖被转化为细胞菌体和主要代谢产物乳酸,探究葡萄糖消耗速率与表征乳酸生成的发酵pH下降速率的关系,是研究保加利亚乳杆菌代谢流方向的重要方法。该实验通过培养基组成和培养条件对保加利亚乳杆菌生长的影响进行研究,同时对葡萄糖消耗速率-pH降低速率相关模型研究,并基于底物质量守恒定律建立了一条基于pH下降速率的保加利亚乳杆菌高密度培养的反馈补料发酵策略。通过化学中和法控制发酵pH为6.0～5.0,基于pH下降速率进行反馈补料将葡萄糖质量浓度控制在8～2 g/L,发酵液的活菌数达到3.6×10⁹ CFU/mL,是批次分批培养的2.4倍。该策略的应用结果为提高保加利亚乳杆菌的工业化生产效率提供参考。     

生物法转化分离耦合制备γ-癸内酯

研究通过添加树脂AB-8吸附转化产物以降低高浓度产物对Yarrowia lypolitica细胞的毒性,进而提高产量。确定了蓖麻油添加量25 g/L、树脂量7.5%、pH值7.5的最佳优化工艺,产物的最大比生成速率提高36%且达到最大值后降低较慢,有利于产物积累,56 h后总产量达到2.17 g/L,耦合工艺在提高产量的同时又能较好地实现产物的分离。     

提高不对称还原合成(R)-扁桃酸的效率

以葡萄酒酵母Saccharomyces ellipsoideus为催化剂,对提高不对称还原苯乙酮酸生产(R)-扁桃酸效率进行了研究,分别利用了分批补料、添加吸附树脂的方法降低底物对反应过程的抑制作用,提高反应的底物浓度。并且通过对吸附树脂吸附性能的考察,筛选出了一种对底物有较快吸附速率和较大吸附量的树脂NKAⅡ,可以显著降低底物对反应过程的抑制,提高反应的底物浓度。最终发现将两种方法结合,在添加吸附树脂的体系中进行分批补料是最高效的方法,将底物浓度从33.31 mmol/L提高到166.53 mmol/L,并且产率达到了91.6%,e.e.值为100%,而且菌体重复使用性能很好。     

新型醛酮还原酶不对称转化制备(S)-N,N-二甲基-3-羟基- 3-(2-噻吩)-1-丙胺

生物催化具有反应条件温和、绿色环保、高立体选择性等优点,已成为制备光学活性度洛西汀的重要方式和途径,但仍存在有效的生物催化剂数量有限和反应效率低等问题,基因组数据库的发展为新型立体选择性生物催化剂的开发提供了有效的途径和平台。本研究通过基因组信息挖掘,从Candida parapsilosis CCTCCM 203011中发现了8个新型的醛酮还原酶,分析研究不同的醛酮还原酶对N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DKTP)的催化还原能力,发现CPAR4能够高立体选择性地催化还原DKTP生成度洛西汀中间体(S)-N,N-二甲基-3-羟 基-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DHTP)。通过粗酶体系反应参数的优化,CPAR4催化还原底物浓度在3g/L时,产率达到94.5%,光学纯度大于99.9%ee;当底物浓度为5g/L 时,产率仍达到70%以上。该重组菌粗酶液能够高立体选择性地生物还原DKTP生成度洛西汀中间体 (S)-DHTP,具有一定的应用潜力。     

一种新的高立体选择性羰基还原酶的性质及分离

从近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis CCTCC 203011）中分离得到了新的NADPH依赖型羰基还原酶。粗酶经硫铵分级沉淀、DEAE Sepharose离子交换层析、Phenyl-sepharose FF疏水层析、Blue Sepharose FF亲和层析后在SDS-PAGE上显示为单一条带,其酶蛋白的相对分子质量为30 kD。该酶还原反应的最适pH值为4.5,最适温度为35 ℃,Cu2+对羰基还原酶有强烈的抑制作用。该酶具有较高的底物专一性和立体选择性,对α-羟基苯乙酮和4-氯乙酰乙酸乙酯具有较高的不对称还原活力,其产物分别为（S）-苯基乙二醇和(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯,e.e值分别为100%和94.3%。因此该酶蛋白是不对称合成手性醇有效的生物催化剂之一。经LC-MASS-MASS分析得到了酶蛋白中一个肽段的氨基酸序列,通过比对发现该酶与假定蛋白（hypothetical protein CaO19.10414）具有一定的同源性。     

红曲色素的色调及发酵工艺条件对色调的影响

用扫描式分光光度计对 3种纯红曲色素及板层析分离的色素进行分析 ,得出了其特征性吸收峰及对应波长。安卡红曲黄素 (黄色 ) ,红曲玉红素 (橙色 )分别在 388nm ,464nm ,而红斑玉红胺 (紫色 )在 51 6nm和 41 8nm 2处有吸收峰。复合色素的主吸收峰在 490～ 50 0nm处。此外 ,板层析上还有深黄和米黄等色素。红曲米的色调取决于多种色素的相对比例。红曲米的发酵工艺条件对色素的相对比例具有重要的影响。锌离子对红曲霉产色素具有促进作用。培养过程中添加醋酸不利红曲霉产生橙色素 ,而有利黄色素的产生。     

酵母耦合原位分离技术不对称合成(R)-扁桃酸甲酯

以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae AS2.1392)全细胞为催化剂不对称还原苯甲酰甲酸甲酯合成(R)-扁桃酸甲酯,该催化剂催化速度快、操作稳定性好。研究了底物和产物浓度对反应初速度的影响,建立了底物和产物抑制模型,并采取分批加入底物和添加树脂的方式解除底物和产物抑制。通过考察不同树脂对底物和产物的吸附量以及对生物还原反应的影响,筛选出了一种较适合的大孔吸附树脂NKA-Ⅱ。在优化的树脂加入量和加入模式下,当底物浓度为180mmol/L时,产物产率由35.0%提高到71.2%,对映体过量值(ee)保持在95%左右。